高渗诱导因子NFAT5对关节软骨细胞MMP13表达的影响

摘要

目的：本文通过对骨性关节炎软骨细胞生存微环境（高渗、力学载荷）的模拟，探讨高渗及力学载荷如何引发软骨组织的损伤，进而导致骨关节退变或骨关节炎形成的分子机制。
　　方法：采用NaCl制备高渗培养基（350mOsM-500mOsM）和12％周期性拉伸力模拟骨关节软骨细胞所处的渗透压范围和力学微环境。利用免疫荧光染色法和甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞标志物 II型胶原(Collagen II)、蛋白聚糖（proteoglycan，PG）；采用MTT法检测不同渗透压浓度下软骨细胞增殖状况，并绘制细胞活力曲线；利用蛋白免疫印迹、RT-qPCR和免疫荧光染色检测活化T细胞转录因子5(nuclear factor of activated T cells，NFAT5)、金属应答元件转录因子(metal regulatory transcription factor1,MTF1)以及基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase，MMP13)的表达。此外，采用p38 MAPK、ERK和JNK等抑制剂考察NFAT5转录活性的变化在金属应答元件转录因子MTF1以及MMP13的表达中的作用。
　　结果：尽管随着渗透压的升高软骨细胞增殖速率减慢，但其活力并没有受到显著影响。Western blot和免疫荧光染色结果表明：高渗（350-500mOsM）上调NFAT5表达，并促进其从细胞质进入细胞核中。同时，mRNA水平的RT-qPCR检测结果表明：随着渗透压的升高，MTF1及下游MMP13表达量随NFAT5表达上调而显著增加。不同时间(3h、6h、12h)的12%CTS加载可显著促进NFAT5、MTF1及下游MMP13基因的表达。ERK、p38 MAPK等抑制剂调控NFAT5的转录活性可显著降低了高渗对MMP13上调的作用。
　　结论：高渗/力学载荷环境可能通过NFAT5途径调节SD大鼠关节软骨细胞中MTF1及其下游MMP13的表达，进而引起软骨细胞外基质发生降解，导致关节软骨退变或OA的形成。
　　目的：本文通过对骨性关节炎软骨细胞生存微环境（高渗、力学载荷）的模拟，探讨高渗及力学载荷如何引发软骨组织的损伤，进而导致骨关节退变或骨关节炎形成的分子机制。
　　方法：采用NaCl制备高渗培养基（350mOsM-500mOsM）和12%周期性拉伸力模拟骨关节软骨细胞所处的渗透压范围和力学微环境。利用免疫荧光染色法和甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞标志物 II型胶原(Collagen II)、蛋白聚糖（proteoglycan，PG）；采用MTT法检测不同渗透压浓度下软骨细胞增殖状况，并绘制细胞活力曲线；利用蛋白免疫印迹、RT-qPCR和免疫荧光染色检测活化 T细胞转录因子5(nuclear factor of activated T cells，NFAT5)、金属应答元件转录因子(metal regulatory transcription factor1,MTF1)以及基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase，MMP13)的表达。此外，采用p38MAPK、ERK和JNK等抑制剂考察NFAT5转录活性的变化在金属应答元件转录因子MTF1以及MMP13的表达中的作用。
　　结果：尽管随着渗透压的升高软骨细胞增殖速率减慢，但其活力并没有受到显著影响。Western blot和免疫荧光染色结果表明：高渗（350-500mOsM）上调NFAT5表达，并促进其从细胞质进入细胞核中。同时，mRNA水平的RT-qPCR检测结果表明：随着渗透压的升高，MTF1及下游MMP13表达量随NFAT5表达上调而显著增加。不同时间(3h、6h、12h)的12%CTS加载可显著促进NFAT5、MTF1及下游MMP13基因的表达。ERK、p38 MAPK等抑制剂调控NFAT5的转录活性可显著降低了高渗对MMP13上调的作用。
　　结论：高渗/力学载荷环境可能通过NFAT5途径调节SD大鼠关节软骨细胞中MTF1及其下游MMP13的表达，进而引起软骨细胞外基质发生降解，导致关节软骨退变或OA的形成。

目录

英文缩略词

1 绪 论

1.1 问题的提出及研究意义

1.2 国内外研究现状

1.3 研究目的与研究内容

1.4 本文的创新之处

2 SD大鼠关节软骨细胞的培养与鉴定

2.1 引言

2.2 材料与试剂

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 分析讨论

2.6 本章小结

3 高渗/周期性压应力对软骨细胞的影响

3.1 引言

3.2 材料与仪器

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 分析讨论

3.6 本章小结

4 与调控作用相关的信号通路

4.1 引言

4.2 材料与仪器

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 分析讨论

4.6 本章小结

5 结论与展望

5.1 主要结论

5.2 后续展望

致谢

参考文献

附录

A. 作者在攻读学位期间参与的科研项目目录

B. 作者在攻读学位期间发表的论文