补体调节蛋白CD46、CD55、CD59在动脉粥样硬化中的表达研究

摘要

研究目的：
　　利用高脂饮食诱导的载脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠为动脉粥样硬化模型，探讨补体调节蛋白中膜辅助蛋白（membrane cofactor protein,CD46）、衰变加速因子（decay accelerating factor,CD55）、膜反应性溶解抑制物（membrane inhibitor of reactive lysis,CD59）在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）中的表达。
　　研究内容和方法：
　　1、构建小鼠AS模型
　　8只5周龄体重在18-22g雄性SPF级C57BL/6J载脂蛋白E基因敲除小鼠为实验组（FS组），8只相同周龄及体重范围雄性SPF级C57BL/6J小鼠为对照组（NS组）。两组小鼠正常饲料喂养1周后，分别予高脂饲料喂养(1％胆固醇+15%猪油)。
　　在高脂喂养15周后，收集实验标本。小鼠空腹过夜，经1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，摘除眼球收集血液标本，并冻存。用冷PBS冲洗左侧心腔及动脉腔内的残血后，钝性分离自主动脉瓣至腹主动脉分叉处的主动脉节段，进行实验分析。采用全自动生化分析仪测定小鼠血清中总胆固醇(total cholesterol，TC)含量。将主动脉纵向剖开后钉于蜡板上，观察主动脉段内膜是否有浅黄色斑块形成，再进行苏丹IV染色以观察内膜脂纹形成情况。对主动脉行石蜡切片，HE染色镜下观察血管是否有泡沫细胞及脂核或脂质池形成。综合以上指标判断ApoE基因敲除小鼠AS模型是否构建成功。
　　2、检测AS病变血管免疫复合物-IgG的沉积
　　建立高脂饮食诱导的AS动物模型后，于无菌操作台上分离主动脉。取主动脉瓣至升主动脉的主动脉段，予4%中性甲醛固定并做石蜡包埋。切片后，应用免疫组化技术检测血管壁免疫复合物-IgG。探讨AS病变血管是否存在免疫反应。
　　3、检测AS病变血管补体C3(complement3,C3)和膜攻击复合物（membrane attack complex,MAC）的表达
　　上述主动脉段蜡块，切片后，应用免疫组化技术检测血管壁补体C3、MAC蛋白的表达。探讨AS病变血管是否存在补体激活。
　　4、检测AS病变血管补体调节蛋白中CD46、CD55及CD59的表达
　　上述主动脉段蜡块，切片后，应用免疫组化技术检测血管壁补体调节蛋白CD46、CD55及CD59的表达。探讨AS病变血管是否存在补体调节蛋白表达。
　　5、检测AS外周血单个核细胞补体调节蛋白CD46、CD55及CD59的表达
　　收集NS组和FS组小鼠的血液，分离外周血单个核细胞，提取总蛋白，应用蛋白免疫印迹法检测外周血单个核细胞补体调节蛋白CD46、CD55及CD59的表达。探讨AS外周血单个核细胞是否存在补体调节蛋白的表达。
　　研究结果：
　　1、小鼠AS模型的评价
　　1.1、体重变化：高脂饲养15周后，NS组和FS组小鼠体重无明显差异。（WT：29.10±2.53g vs.33.20±5.18g P＞0.05）。
　　1.2、血清总胆固醇变化：FS组较NS组小鼠血清总胆固醇显著增高(TC：13.52±1.58 mEq/L vs.2.12±0.35 mEq/L P＜0.01)。
　　1.3、血管病理改变：NS组主动脉内膜平整、光滑，无脂质沉积；FS组主动脉内膜面有淡黄色斑块状隆起，散在或融合成片，以主动脉瓣口至升主动脉处最为明显。
　　1.4、苏丹IV染色：NS组主动脉内膜光滑，无着色呈现内膜本色；FS组主动脉内膜斑块状隆起处被染成猩红色，无斑块处呈现内膜本色，红白分明。表明FS组主动脉内膜在大体标本上出现明显的AS斑块。
　　1.5、HE染色：NS组主动脉内膜光滑、完整、无增厚，内皮下无脂质沉积，中膜平滑肌细胞排列整齐；FS组主动脉内膜明显增厚，可见脂质斑块形成，斑块内有大量泡沫细胞，管腔明显狭窄，中膜平滑肌细胞显著紊乱。表明 FS组主动脉形成 AS斑块。
　　综上结果：显示该模型指标符合动脉粥样硬化的表现，AS模型构建成功。
　　2、AS病变血管免疫复合物-IgG的表达
　　免疫组化结果显示：与NS组比较，FS组小鼠主动脉壁免疫复合物-IgG（平均光密度值：90.77±40.44 vs.0.96±0.15，P＜0.01，）表达显著增高，表明AS病变血管出现免疫反应。
　　3、AS病变血管C3和MAC的表达
　　免疫组化结果显示：与NS组比较，FS组小鼠主动脉壁补体C3（平均光密度值：261.5±68.02 vs.2.00±1.44，P＜0.01）和MAC（平均光密度值：135.08±89.60 vs.8.79±3.59，P＜0.01）蛋白表达均显著增高。表明AS病变血管有补体激活。
　　4、AS病变血管CD46、CD55及CD59的表达
　　免疫组化结果显示：与NS组比较，FS组小鼠主动脉内CD46（平均光密度值：24.14±0.25 vs.0.39±0.09，P＜0.01）、CD55（平均光密度值：55.23±2.85 vs.10.04±3.76，P＜0.01）和CD59（平均光密度值：38.08±0.68 vs.0.07±0.02，P＜0.01）蛋白表达均显著增高。表明AS病变血管补体调节蛋白CD46、CD55、CD59激活。
　　5、AS外周血单个核细胞CD46、CD55及CD59的表达
　　蛋白免疫印迹法的结果显示，NS、FS两组小鼠外周血单个核细胞CD59蛋白低表达，未能检测出。与NS组比较，FS组中CD46蛋白的表达无明显差异（灰度值：76.92±1.54 vs.92.35±9.62，P＞0.05）；而CD55蛋白表达有显著下降（灰度值：6.97±3.71 vs.29.60±10.91，P＜0.01）。这表明在AS模型中外周血单个核细胞补体调节蛋白CD46、CD55、CD59表达无增加。
　　结论：
　　本研究显示：在高脂饮食诱导的ApoE基因敲除小鼠AS模型中，动脉粥样硬化血管存在免疫反应、补体激活和补体调节蛋白（CD46、CD55、CD59）激活；但外周血单个核细胞补体调节蛋白（CD46、CD55、CD59）表达无增加。

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中英文缩略词表

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前 言

材料与方法

1、主要试剂与材料

2、主要仪器

3、主要试剂配制

四、实验方法

1. 实验动物模型构建及分组：

2. 实验动物标本的采集：

3．大体血管苏丹Ⅳ染色：

4. 血清标本血脂的检测：

5. 制作标本蜡块：

6. HE染色：

7. 免疫组织化学技术检测主动脉血管壁免疫复合物-IgG、C3、MAC、CD46、CD55 及CD59蛋白的表达：

8. 蛋白免疫印迹法技术检测外周血单个核细胞CD46、CD55及CD59蛋白的表达：

9、统计学方法

结 果

1、AS动物模型的评价

2、免疫组织化学检测主动脉血管壁免疫复合物-IgG、C3、MAC、CD46、CD55及CD59蛋白的表达情况

3、蛋白免疫印迹法技术检测 CD46、CD55及 CD59 蛋白在外周血单个核细胞的表达情况

1、AS动物模型的评价

2、免疫反应与AS斑块的关系

3、补体系统的固有成分与AS斑块的关系

4、补体激活致AS的可能机制

5、补体调节蛋白与AS斑块的关系

结 论

参考文献

附图

综 述

致谢

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