水通道蛋白1调节肺动脉平滑肌细胞迁移与增殖的相关机制研究

摘要

肺泡性缺氧是许多肺疾病的重要组成部分,并且对肺血管损伤较大。慢性缺氧可导致肺血管收缩内径减小,并发生血管重塑,从而导致肺动脉高压。发生在肺动脉的血管重塑,可能是由于肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的迁移和增殖造成。有研究表明,肺动脉中间平滑肌层的增厚程度与从慢性缺氧小鼠模型体内分离出的远端肺动脉内增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞的数量明显相关。细胞迁移在许多疾病的病理生理过程中起着非常重要的作用,如癌症、炎症以及血管疾病等。有文献表明,PASMCs的迁移参与了肺小血管的肌化。虽然经过多年研究,肺血管重塑以及PASMCs增殖和迁移的机制仍然不清。
　　水通道(AQP)是能转运水分子以及一些小分子如甘油的细胞膜蛋白。大约有13种AQP表达在许多种类的细胞上,如内皮细胞、上皮细胞以及平滑肌细胞。水通道蛋白1(AQP1)是第一个被发现的水通道蛋白,有文献报道其促进上皮细胞、内皮细胞以及一些肿瘤细胞的迁移,但机制不清。有研究人员发现AQP1在主动脉以及冠状动脉平滑肌细胞上表达,但PASMCs上是否存在AQP的表达以及其功能仍然未知。
　　AQP1由6个右手跨膜a-螺旋组成,该蛋白的碳端和氮端均位于细胞浆内。并且6个跨膜a-螺旋结构组成了5个穿过细胞膜的环状结构(A-E)。AQP1的C尾由37个氨基酸组成并位于细胞内。位于AQP1C尾的EF-hand区域是一种在许多钙结合蛋白中存在的螺旋-环-螺旋结构。该结构由两个相互垂直的a-螺旋并由一个短环连接,短环区域可结合钙离子。有很多研究表明Ca2+与缺氧介导的细胞迁移与增殖有关。Ca2+与位于AQP1C尾的EF-hand区域结合后可能调控PASMC的增殖和迁移。
　　在本课题第一部分,我们首先将采用RT-PCR以及免疫印迹的方法检测AQP在肺动脉以及PASMCs内的表达,并与主动脉平滑肌细胞(AoSMCs)内AQP的表达相比较,然后确定缺氧是否会上调AQP1的表达。在本课题第二部分,我们将研究AQP1在调节PASMC迁移与增殖中的作用。由于AQP1的C尾内含有一个Ca2+结合位点以及一些蛋白结合位点,这些结合位点和相关因子结合后可能调控AQP1的表达和功能,因此我们假设AQP1的C尾可能与细胞的增殖和迁移相关。为了验证这个假设,我们将采用AQP1敲除以及过表达野生型AQP1的方法研究其对PASMCs增殖和迁移的作用。我们还将对缺失AQP1C尾或突变C尾上的EF-hand区域进一步研究其对PASMCs增殖和迁移的作用。
　　目的：
　　研究AQP是否在PASMCs上表达并确定缺氧是否会上调AQP1的表达。然后探讨AQP1在调节PASMCs增殖和迁移中的作用,以及缺氧引起的细胞内钙离子浓度增加是否与依赖于AQP1的细胞迁移有关。进一步研究AQP1的C尾以及C尾上的EF-hand区域对细胞增殖和迁移的影响,阐明慢性缺氧导致PASMCs增殖和迁移的机制。
　　方法:
　　1、大鼠缺氧模型的建立:将成年雄性Wistar大鼠(250-300克)放于氧浓度为10％的缺氧箱中3周。缺氧箱内不断通入空气以维持较低的CO2浓度(<0.5%)。氧浓度监测系统负责监测缺氧箱内氧浓度,并充入纯氮气维持氧浓度在10±0.5%。每个星期清洁饲养笼并加水及食物两次。处于常氧环境的对照组大鼠放于缺氧箱旁边。所有大鼠均保持昼夜正常节律并自由摄取水和食物。
　　2、PASMCs的培养:雄性Wistar大鼠(250-300g)用戊巴比妥钠(130mg/kg)麻醉。剪去肺和心脏,把肺泡在HBSS缓冲液中并分离肺动脉(>4级),然后把肺动脉剪开用棉签刮去内皮。去除内皮的肺动脉在4℃HBSS内浸泡30分钟,然后放入已平衡室温的低钙HBSS内继续浸泡。然后把组织放入由低钙HBSS配制的含I型胶原酶、木瓜酶、牛血清白蛋白(BSA)以及二硫苏糖醇(DTT)的消化液内37℃消化20分钟。PASMCs用SmBM培养基培养48小时,然后用含10%胎牛血清的SmGM培养基在细胞培养箱内培养2-4天。在进行实验之前24-48小时,把培养细胞的完全培养基换成基础培养基。
　　3、普通PCR以及实时荧光定量PCR(Real-timePCR):用Trizol提取肺动脉的RNA,测浓度后保存在-80℃。逆转录反应体系包括逆转录酶、dNTPs、无核酸酶的超纯水以及缓冲液。普通PCR反应体系包括5mlMgCl2缓冲液、1.5mlMgCl2、1mldNTPs、3mlcDNA以及2ml正向和反向引物,充分混合后放入PCR仪内。反应完成后,PCR产物进行1%琼脂糖电泳并照相,然后测序鉴定。为了进行定量,用QuantiTectSYBRGreenKit进行Real-timePCR反应。Real-timePCR反应产物的特异性通过溶解曲线为单峰以及胶回收进行检测。每个基因的相对浓度用Pfaffl法进行计算。结果用目的基因与管家基因的比值表示,并用对照组进行标准化。
　　4、载体构建:先用ClaI酶切消化表达人AQP1的AQP1-SPORT6载体,然后通过BP反应连接pDONR221和消化后的AQP1-SPORT6,测序后连入病毒载体pAd/CMV/V5-DEST。以AQP1-SPORT6载体为模板,用PCR的方法扩增出血细胞凝集素(HA)标记的AQP1以及缺失C尾的AQP1,然后琼脂糖电泳纯化后连入pCR-BluntII-TOPO载体。我们用Quick-ChangeII点突变系统突变EF-hand区域,具体方法为以AQP1-BluntII载体为模板进行PCR扩增。PCR扩增后连入pCR-BluntII-TOPO的载体,然后用KpnI和XhoI消化后连入已消化的pENTR-2B载体,最后通过LR反应连入转录缺陷腺病毒载体。这些病毒载体经PacI消化后去除在细菌内表达的序列,再用脂质体2000转染到HEK293A细胞内。转染后24小时,细胞换成新的培养基,大约经过19天左右病毒可产生。收集含有病毒的培养基后经过三次冻融循环用病毒纯化试剂盒进行纯化。最后用病毒测定滴度试剂盒进行滴度测定。PASMCs长至70-80%融合度时换成含0.3%胎牛血清的SMBM培养基,以50ifu/细胞的浓度处理细胞4小时后换成新鲜SMBM培养基,24小时后可进行后续实验。
　　5、免疫印迹实验:经过各种处理的PASMCs加入含蛋白酶抑制剂并预冷的TPER后用细胞刮把细胞刮下来。细胞裂解液用BCA法测浓度后上样20-30μg,然后用12%SDS-PAGE胶进行分离。分离后的蛋白转到PVDF膜上,PVDF膜用含5%奶粉的TBST封闭,然后加入AQP1、AQP4、AQP7、HA或a-actin抗体孵育2小时,充分洗掉一抗后加入辣根过氧化物酶标记的抗兔或抗小鼠二抗,洗掉二抗后加入ECL曝光。
　　6、迁移实验:孔径为8μm的Transwell放入6孔板内然后加入4ml的基础培养基,然后向Transwell上加入75,000-100,000个细胞。细胞在常氧或缺氧条件下放置24小时后,用95%乙醇固定10分钟,然后染色5分钟。然后,用带有成像系统的显微镜照相。每个Transwell我们随意选取5个视野进行照相,未迁移的细胞用棉签刮去后再进行拍照。最后用已迁移的细胞数除以总的细胞数得到细胞迁移率。
　　7、siRNA转染:向PASMCs内转染siAQP1或siNT,使其终浓度为100nM。6小时后换为无抗生素的培养基。24小时后,细胞内的培养基换成基础培养基。细胞再培养24小时后,可用于后续实验。
　　8、细胞增殖实验:向96孔板内加入7,500细胞/孔进行培养。72小时后,加入BrdU继续培养24小时。去除培养基后,固定细胞。BrdU掺入新合成的DNA后用辣根过氧化物酶标记的BrdU抗体进行结合,然后选择450nm波长在96孔板分光光度计进行检测。吸光度值与DNA合成的量呈正相关,因此与增殖细胞的数量也呈正相关。
　　9、细胞膜生物素化实验:细胞经3次PBS漂洗后加入溶于PBS的生物素(0.5mg/ml)孵育30分钟使细胞膜生物素化。未结合的生物素加入50mMTris(pH8.0)进行中和。PASMCs用溶解缓冲液进行裂解并用BCA法确定蛋白浓度。然后加入和链霉亲和素结合的琼脂糖珠子免疫沉淀已生物素化的蛋白。免疫沉淀物用溶解缓冲液漂洗4次后,溶于laemmli缓冲液,然后上样进行免疫印迹实验。
　　10、免疫荧光实验:生长在玻片上的PASMCs用胰蛋白酶消化2分钟后,用PBS漂洗然后用4%福尔马林溶液固定细胞10分钟,再加入0.5%TritonX-100孵育10分钟。细胞封闭1小时,漂洗后加入AQP1或HA抗体孵育2小时。然后,细胞加入二抗孵育1小时。最后,细胞加入细胞膜标记物孵育10分钟。晾干并封片后用激光共聚焦显微镜进行检测。
　　11、细胞体积实验:细胞消化后铺在玻片上并在细胞培养箱内孵育1小时,然后细胞装在一个封闭的小室内置于显微镜下,依次通入等渗、高渗以及低渗HEPES,每种HEPES分别灌流15分钟,并每分钟照一张照片。最后用ImageJ软件测量细胞直径,用球体公式计算细胞体积。
　　12、细胞内钙离子浓度的测量:细胞加入7.5mMFura2-AM37℃孵育60分钟后放入小室内,然后把小室放在倒置显微镜下灌流KREBS溶液。进行实验前细胞先灌流KREBS液15分钟去除细胞外染料。用×20的荧光物镜并通过340和380nm波长检测Fura2的荧光,然后用InCyte软件检测细胞信号。细胞内的钙离子浓度由Fura2荧光比值计算得出。
　　结果:
　　1、AQP在PASMCs上的表达:普通PCR结果显示AQP1、AQP4以及AQP7在PASMCs上表达,AQP1表达较丰富,AQP4以及AQP7的表达较少。而AoSMCs上表达的AQP与PASMCs上类似。免疫印迹实验也进一步证明了AQP1、AQP4以及AQP7在PASMCs和AoSMCs上的表达。AQP1和AQP7在两种细胞内的表达量类似,而和PASMCs相比,AoSMCs上表达更多的AQP4。
　　2、AQP在缺氧大鼠模型体内肺动脉平滑肌中的表达以及作用:在缺氧条件下,肺组织内AQP1蛋白表达水平增加,而AQP4和AQP7蛋白表达水平无明显改变。为了确定缺氧对平滑肌的作用,我们还研究了AQP在常氧以及缺氧大鼠去除内皮的肺动脉内的表达,结果与肺组织内相同。荧光定量PCR结果显示,在慢性缺氧条件下AQP1mRNA水平升高,而AQP4和AQP7mRNA水平无明显变化,这与蛋白水平相一致。
　　3、在体外缺氧对AQP1表达的影响:为了验证细胞与细胞之间的接触是否会改变缺氧的作用,我们用1ml的枪头划细胞使细胞的融合度降到50%,这样也使细胞与细胞之间产生间距,让细胞向间隙内迁移。在这种条件下,和对照条件相比,AQP1蛋白水平上调(但没有显著差异,P=0.063),而缺氧使AQP1升高的更明显。而缺氧以及划痕却并不能增加AQP1在AoSMCs上的表达。与体外长期缺氧的结果相反,体外短期缺氧并不影响AQP1mRNA在PASMCs上的表达,这同样与细胞是否被划过无关。
　　4、AQP1敲低对PASMC增殖和迁移的作用:与转染siNT相比,转染siAQP1明显降低70%AQP1蛋白的表达,而用siAQP1处理细胞并不影响AQP4的表达,这表明AQP1敲低的特异性。在缺氧条件下,用siNT处理细胞后,细胞表现出更高的增殖和迁移。而在对照条件下,用siAQP1处理细胞并不能明显降低细胞的迁移,却能明显降低细胞的增殖。在缺氧条件下,用siAQP1处理细胞能完全抑制缺氧所造成的细胞增殖和迁移的增加。
　　5、钙在缺氧介导的迁移中的作用:在常氧环境下的细胞内Ca2+大致相同,而缺氧可使暴露在4%O215分钟或24小时的PASMCs以及从慢性缺氧大鼠体内分离出的PASMCs内的Ca2+明显升高。和PASMCs相比,在常氧条件下AoSMCs内的基础钙稍微低一些(P<0.05),而缺氧并不能使AoSMCs内的基础钙浓度增加。用VER和SKF进行处理可抑制缺氧所介导的PASMC迁移的增加。缺氧可增加划痕细胞内AQP1的表达,而VER或SKF可抑制缺氧所介导的AQP1表达的增加。
　　6、AQP1过表达对PASMC增殖和迁移的作用:与感染AdGFP相比,PASMCs内感染AdAQP1将明显增加AQP1总蛋白的表达,也能明显增加AQP1的细胞膜生物素化。与细胞感染AdGFP相比,用AdAQP1进行处理可明显增加PASMC的迁移和增殖,这与在缺氧条件下观察到的结果相同。
　　7、AdAQP1CT-HA和AdAQP1M-HA的细胞定位:感染AdAQP1,AdAQP1-HA,AdAQP1CT-HA,AdAQP1M-HA的PASMCs图片显示细胞膜与这些蛋白完全重合,这表明有或没有HA标记的AQP1,缺失C尾的AQP1以及EF-hand区域突变的AQP1均能正确在细胞膜上表达。
　　8、过表达的野生型AQP1,缺失C尾或EF-hand区域突变的AQP1均具有水通道的功能:当细胞灌流低渗HEPES缓冲液后,与感染AdGFP的PASMCs相比,感染AdAQP1,AdAQP1CT-HA,AdAQP1M-HA的细胞的体积变化明显加快。
　　9、缺失C尾的AQP1对PASMC增殖和迁移的作用:当孵育HA抗体,只有感染AdAQP1-HA以及AdAQP1CT-HA的PASMCs表达HA蛋白。当孵育AQP1抗体,与感染AdGFP的细胞相比,感染AdAQP1以及AdAQP1-HA的PASMCs表达更多的AQP1蛋白,而感染AdAQP1CT-HA并不能改变PASMCs增殖和迁移。
　　10、EF-hand区域突变的AQP1对PASMC增殖和迁移的作用:当孵育HA抗体,只有感染AdAQP1-HA以及AdAQP1M-HA的PASMCs表达HA蛋白。与感染AdGFP的细胞相比,感染AdAQP1M-HA的PASMCs能明显增加细胞的增殖和迁移。
　　结论:
　　AQP1、AQP4以及AQP7在PASMCs上表达。缺氧促进AQP1的表达。AQP1对PASMCs的增殖和迁移具有重要作用,虽然机制尚不清楚,但与AQP1的C尾有关。EF-hand区域与AQP1介导的PASMCs的增殖和迁移无关。而AQP1介导的增殖和迁移同样与AQP1的水通道功能无关。钙通道阻滞剂可以抑制缺氧所引起的细胞迁移增加以及缺氧介导的AQP1表达增加。

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中英文对照词汇表

中文摘要

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前言

第一部分 水通道蛋白家族在远端肺动脉以及肺动脉平滑肌细胞上的表达以及缺氧对其调节作用

材料和方法

结果

讨论

第二部分 水通道蛋白1调节肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的机制研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

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