新生儿急性呼吸窘迫综合征血清microRNA谱的初步研究

摘要

研究目的:
　　本研究旨在筛选新生儿ARDS血清中差异表达的miRNAs,并评估利用筛选出的血清miRNAs作为新生儿ARDS早期诊断标志物的可行性。
　　研究方法:
　　本研究共分两个部分。
　　第一部分:收集新生儿ARDS患儿血清各50例,健康新生儿血清32例,随机选取9例病例组(ARDS组)及3例健康对照组(NC组)的血清,提取血清总RNA(含有miRNAs),利用miRNA芯片筛选出ARDS相对于正常组的差异性miRNAs表达谱。根据预设的条件,从初步筛选出的miRNAs中进一步筛选以进行第二部分的研究。
　　第二部分:随机选取18例ARDS及17例NC组新生儿的血清标本,采用TaqManqRT-PCR的方法对第一部分中筛选出的2种候选miRNAs进行定量研究和验证,比较这两种miRNAs的表达水平在各组间的差异是否与芯片结果一致,并对其检验效能进行评价。
　　实验结果:
　　第一部分:
　　1、两组血清样本均可提取出合格的RNA
　　分别从ARDS组及NC组血清中提取总RNA,采用分光光度法检测OD260/280,比值均符合要求。
　　2、总RNA与miRNA芯片杂交
　　用ARDS组及NC组提取出的总RNA与miRNA芯片杂交,得到9张成像均匀、清晰的杂交图像,可证实总RNA中含有miRNAs。
　　3、miRNAs在ARDS组及NC组血清中表达存在差异
　　采用GenePixproV6.0软件,对探针点的初始荧光强度进行分析,然后对初始强度值进行标准化及归一化处理,筛选出两组间差异表达的miRNAs。以表达水平变化倍数R≥2为界,共有318种差异表达的miRNA,其中132种在ARDS病例组相对于健康对照组上调,186种下调。
　　4、筛选出两种候选miRNAs
　　以表达水平变化倍数R≥15为界,将上调和下调倍数在前5位的miRNAs选出,计算标准值ARDS-NC,最后筛选出两种miRNA作为候选的血清学标志物。
　　第二部分:
　　1、各血清标本中均可提取出合格的RNA
　　两组血清标本提取的总RNA,OD260/280的比值均符合要求。
　　2、外参基因表达稳定
　　参考文献,初步选定线虫miR-39作为外参基因。通过检测其在各标本间的表达水平,结果显示,两组间外参的Ct值未见显著性差异。
　　3、候选miRNAs的初步验证与筛选
　　外参线虫miR-39及目标miRNA均能有效扩增。以参线虫miR-39为外参,对各miRNAs的表达水平进行标准化分析,通过统计学分析发现,第一部分实验中筛选出的miR-3120及miR-20a在ARDS组及NC组之间的表达存在显著性差异,芯片与PCR结果一致。
　　4、miR-3120及miR-20a的检验效能
　　以此次入组的血清样本为基础(N=35),利用ROC曲线分析miR-20a及miR-3120对ARDS和健康对照组的鉴别效能。结果显示,miR-20a通过ROC分析得到的最佳cut-off值为82.1,敏感性和特异性分别为94.1％和94.4%,得到的曲线下面积(AUC)为0.99;miR-3120的最佳cut-off值为27.3,敏感性和特异性分别为50.0%和70.6%,得到的曲线下面积(AUC)为0.52。
　　结论:
　　1、新生儿ARDS患者及健康对照血清中均有miRNAs的表达;
　　2、芯片检测发现,某些miRNAs的血清表达水平在ARDS组及健康对照组之间存在显著性差异,本实验筛选出318种差异表达的miRNA,其中132种在ARDS病例组相对于NC组上调,186种下调;
　　3、进一步筛选出两种miRNAs采用TaqManRT-PCR进行验证,与芯片结果一致;
　　4、利用ROC曲线分析显示,miR-20a在区分ARDS组及NC组有一定的敏感性及特异性,可作为潜在的ARDS血清学标志物。

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中文摘要

英文摘要

中英文缩略词表

前言

第一部分 新生儿ARDS血清差异表达miRNAs的筛选

引言

材料和方法

一、材料

二、方法

结果

一、ARDS组及NC组的临床资料

二、两组血清中提取的总RNA及浓度

三、芯片杂交图像

四、对扫描图像的统计分析

五、血清差异表达miRNA的筛选

讨论

第一部分小结

第二部分 新生儿ARDS血清特异microRNAs的初步验证

引言

材料与方法

一、材料

二、方法

结果

一、临床资料分析

二、血清标本总RNA的质检及定量

三、参照基因的选择及稳定性

四、对候选miRNAs的初步验证

五、PCR结果与芯片结果的比较

六、miR-3120和miR-20a的检验效能

讨论

第二部分小结

参考文献

全文小结

综述

致谢

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