siRNA阻断mGluR5基因表达后对人胶质瘤U251细胞增殖影响的研究

摘要

实验目的：
　　1.通过RNAi技术抑制外培养的U251细胞中的mGluR5的产生,观察对人胶质瘤U251细胞的影响,探讨mGluR5对U251细胞增殖的相关作用。
　　2.使用RNAi技术阻断体外培养的U251细胞中的mGluR5基因的表达,通过观察对胶质瘤U251细胞的影响,寻求胶质瘤治疗的基因靶点。
　　实验方法：
　　1.siRNA的设计:从基因库中找出mGluR5基因序列,之后使用siRNA设计软件、根据siRNA的设计原则,设计出4条siRNA片段,分别为:
　　mGluR5-siRNA-A5′-CCCAAGCATTCGAGAAGTCTA-3′mGluR5-siRNA-B5′-TACGATCCTATTCGATGAGAA-3′mGluR5-siRNA-C5′-CTCCAATTGGGTTGTGAAATA-3′mGluR5-siRNA-D5′-CGCCATCTATTCGATGGCCTA-3′Negativecontrol(NC)5′-UUCUCCGAACGUGUCUTT-3′
　　2.体外培养人脑胶质瘤U251细胞,传六孔板,合成的4条siRNA片段及NC片段各转染一个孔的U251细胞后,收集蛋白进行。以上实验重复多次,分别培养时间为6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时,之后根据每次Westernblot检测结果,选出最佳实验时段。并根据不同实验组mGluR5蛋白量的差异,挑选待实验干扰片段。
　　3.U251细胞传96孔板。分两个实验组,分别为阴性对照组、干扰组。各取10个复孔,按6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时培养后,选取不同培养时间段细胞分别进行水溶性四唑盐比色法(water-solubletetrazolium,WST-1)检测,根据不同时间段吸光值的差异,选出最具代表性的时间段,之后进行统计分析,根据结果判断细胞增殖情况。
　　4.光镜下拍照对比实验组与对照组之间细胞生长的差异,在6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时时间点分别拍照,比较同一时间段内实验组与对照组细胞密度的大小。
　　实验结果：
　　1.Westernbloting检查结果显示:在6小时、12小时两组实验,相同时间段内的各实验组相比较蛋白无明显差异,24小时可得出,mGluR5-siRNA-D片段组蛋白量较同时间段其余四组减少,其余四组之间蛋白量无明显差异。36小时、48小时、60小时、72小时、84小时mGluR5-siRNA-D片段组蛋白量较同时间段其余四组明显减少,mGluR5-siRNA-C片段组蛋白量较同时间段NC、A、B减少,但减少程度不如同时间段mGluR5-siRNA-D片段组明显。
　　2.WST-1结果显示:在6小时、12小时实验组与同时间段对照组吸光值相比无明显差异、24小时差异较小、36小时、48小时、60小时实验组吸光值明显低于同时间段对照组,数值经统计软件统计后,p值小于0.05,差异具统计学意义。在进行72、84小时实验组的实验中,实验组吸光值仍低于对照组,但已不如36小时、48小时、60小时时间段明显,而且发现吸光值数据较大(大于1.2OD)根据本实验试剂盒的使用原则,吸光值过大时结果会出现较大误差。因此,可排除此两组时间段的实验结果。
　　3.镜下观察各个时间段细胞生长状况基本与WST-1实验吻合。在36、48、60小时时间段段实验组细胞数目明显少于同时间段对照组细胞数目。
　　结论：
　　1.mGluR5-siRNA-C、mGluR5-siRNA-D片段都可抑制人胶质瘤U251细胞mGluR5基因的表达,且mGluR5-siRNA-D片段对mGluR5基因表达的抑制效果明显强于mGluR5-siRNA-C片段。
　　2.mGluR5-siRNA-D片段抑制mGluR5基因表达的同时,人胶质瘤U251细胞的增殖受到抑制,证明了mGluR5对人胶质瘤细胞U251的增殖具有促进作用;转染时间在36-60小时之间,细胞增殖受抑制最为明显。说明mGluR5-siRNA-D片段对细胞的转染具有时效性。

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中文摘要

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前言

一．胶质瘤

二．代谢性谷氨酸受体

三．RNA干扰技术

四．课题研究思路

材料与方法

一、材料

二、主要实验设备

三、主要实验试剂、材料和主要溶液的配制

四、 实验方法

结果

讨论

结论

本课题的研究意义及展望

参考文献

综述

缩 略 词

致谢

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