青蒿素缩环二聚体和PI3Kα突变体抑制剂的设计、合成和抗肿瘤活性研究

摘要

众所周知，癌症是当前威胁人类健康的第一杀手，新型抗肿瘤药物的研发也一直是社会关注的重点。由于肿瘤疾病的多样性和复杂性，许多抗肿瘤药物在临床使用中经常出现各类毒副作用。因此提高抗肿瘤药物的靶向性和选择性，开发既可高效的杀灭肿瘤组织又可降低对正常组织毒副作用的抗癌药物具有重大而深远的意义。基于此，本论文拟采用两种策略开展抗肿瘤药物研究工作。其一，利用天然产物毒副作用小的优点，以其分子骨架为基础，设计天然产物的新型衍生物，并提高其抗肿瘤活性。其二，针对肿瘤组织中某些特异存在的异常基因突变现象，通过高通量筛选技术获得先导化合物，然后进行结构优化得到全新骨架的小分子蛋白抑制剂。这类抑制剂精准靶向突变基因表达的蛋白，具有较强抗肿瘤活性，同时毒副作用较低。本论文分为以下几部分： Ⅰ.青蒿素五元缩环二聚体 青蒿素及其衍生物是一类含三氧杂环倍半萜烯结构的具有多种生物活性的化合物。目前，青蒿素及其衍生物已经成为抗疟疾临床治疗的一线用药，而且安全无毒副作用。在抗肿瘤药物研发领域，青蒿素也被广泛关注。但是相对较差的抗肿瘤活性和代谢稳定性是制约其在该领域广泛使用的最大障碍。本论文第一部分工作以天然产物青蒿素为先导化合物，设计合成了一类新颖的青蒿素缩环二聚体结构，使用MTT法检测了这类结构在五株肿瘤细胞和一株正常肝细胞上的抗肿瘤活性。并基于此，详细研究了这类化合物的构效关系，而且对代表性化合物的抗肿瘤生物机理和代谢稳定性进行了研究和讨论。 与青蒿素相比，大部分新合成的二聚体结构表现出更好的抗肿瘤活性，尤其是化合物A-8b对PC12细胞株表现出最佳的抗肿瘤活性（IC50=1.56μM），较青蒿素和二氢青蒿素提高了50倍。进一步生物学机制研究结果表明，化合物A-8b可以阻断肿瘤细胞周期于G1期，同时通过上调Bad，Bax，caspase-3和caspase-9蛋白表达，抑制Bcl-xL的表达实现促凋亡作用。与控制组Dimer-01相比，化合物A-8b表现出延长的代谢半衰期（从8min提高到18.3min）和较低的肝微粒体代谢清除率。说明化合物A-8b具有更好的代谢稳定性。总之，本论文第一次成功将青蒿素缩环制备成了二聚体结构，开发了一类具有明显提升抗肿瘤活性和代谢稳定性同时对正常细胞具有较好耐受作用的新型青蒿素衍生物，为青蒿素类衍生物成为抗肿瘤临床药物提供了有意义的前期研究基础。 Ⅱ.PI3Kα突变体抑制剂 第二部分工作针对肿瘤细胞中异常高表达的PI3Kα突变体，开发相应的小分子选择性抑制剂，提高抗肿瘤化合物的选择性和靶向性，同时降低毒副作用。PI3K通路在肿瘤细胞中异常活跃，近年来，作为一个有希望介入的抗肿瘤药物靶标备受关注。然而，当前的PI3K抑制剂大都存在潜在的耐药性和严重的毒副作用，在多种肿瘤细胞中，编码催化亚基PI3Kα的PIK3CA序列出现频繁的突变现象，而由此基因突变导致PI3Kα结构的变化是激活该信号通路的重要原因之一。鉴于此，我们希望发展一种可以特异性作用于PI3Kα突变体的抑制剂，实现增强治疗效果的同时降低毒副作用。通过使用靶向PI3Kα（H1047R）突变体的同源时间分辨荧光分析技术，筛选小分子化合物库，我们得到了两个潜在母核结构（Hit-01，Hit-02），并分别开展了对这两类母核结构的化学修饰与作用机理研究工作。 第一个母核结构为含有苯乙酮骨架的化合物（Hit-01）。经过化学结构修饰，获得了一系列对PI3Kα突变体激酶具有较好抑制活性，同时对突变体高表达肿瘤细胞株HCT116具有适中抑制活性的化合物。其中化合物B-7h表现出最为优异的活性，其对突变体激酶抑制活性EC50为0.555μM，较初始母核（Hit-01）提高了200倍；对HCT116肿瘤细胞株的抑制活性IC50为10.91μM，较初始母核（Hit-01）提高了10倍。选择HCT116细胞对其抗增殖活性机制进一步研究后发现B-7h可以阻断肿瘤细胞周期于G2/M期，但没有促凋亡作用，其抗肿瘤作用是通过促进肿瘤细胞的自噬而实现。通过免疫印迹法，分析与细胞自噬和PI3K通路相关的蛋白的表达，发现化合物B-7h可以激活细胞自噬调控蛋白并抑制PI3K的磷酸化。 第二个母核结构为具有喹喔啉结构的化合物（Hit-02）。结构改造获得了另一系列的对突变体激酶和高表达该突变体的肿瘤细胞HCT116具有优异抑制活性的化合物。其中，C-7b显示了较强的对PI3Kα突变激酶的抑制活性（IC50=0.137μM），较初始母核（Hit-02）提高了500倍。此外，对HCT116细胞株也显示了较好的抑制作用。进一步生物机制研究发现C-7b可以阻断HCT116细胞周期于G1期，并通过上调capase-8，caspase-3和caspase-9等促凋亡因子的表达来促进细胞凋亡，此外研究发现C-7b对PI3K的磷酸化具有明显的抑制作用。 最后，针对以上两个代表化合物（B-7h和C-7b），我们研究了其对PI3Kα（野生型/突变型），PI3K其他亚型（PI3Kβ，γ和δ）以及mTORC1的选择性抑制作用。结果发现，这两个化合物对PI3Kα（野生型/突变型）具有相似的抑制作用，同时具有很好的PI3Kα异构体选择性，可以减少由于对PI3K其他亚型的抑制而产生的毒副作用。 综上所述，本论文两部分工作都以设计全新的具有较好抗肿瘤活性的化合物，同时避免产生严重的毒副作用为目标，分别采用天然产物和高通量筛选技术获得先导化合物，然后经过化学结构改造和构效关系总结，最终获得了三个具有强效抗肿瘤活性同时具有较低毒副作用的候选化合物（A-8b，B-7h和C-7b），然后对这些候选化合物进行了深入抗肿瘤机制研究，包括细胞周期阻断，细胞凋亡，细胞自噬和相关凋亡因子表达以及对靶点的抑制活性和选择性测试等。通过本论文研究工作的开展，能够为该类抗肿瘤药物的临床前开发提供研究基础。

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