甘蓝型油菜及其亲本物种BAN基因家族的克隆与比较基因组学分析

摘要

甘蓝型油菜(Brassicanapus)是我国最重要的油料作物之一,其黄籽类型与黑籽类型相比有着许多品质优势,黄籽性状是国内外油菜育种的热点之一。虽然作为甘蓝型油菜的亲本物种白菜型油菜(B.rapa)和甘蓝(Brassicaoleracea)都有天然的表现稳定的黄籽类型,但它没有,而通过远缘杂交等方法创造黄籽材料的选育周期长、效率低,尤其是黄籽表型易受环境影响而不稳定。当前急需对甘蓝型油菜和其亲本物种中与黄籽性状相关的重要功能基因进行全长序列的比较克隆,然后进行比较研究,揭示这3个物种间在黄籽性状上的分子遗传学机理,并通过基因工程改良甘蓝型油菜的籽色性状。
　　 甘蓝型油菜黄籽性状形成的分子机理目前还不清楚,但可以借鉴同属于十字花科的拟南芥透明种皮(TRANSPARENTTESTA,TT)性状研究的成果。花青素苷和缩合单宁的合成共用的是一种底物,而由BANYULS(BAN)基因编码的花青素还原酶(Anthocyanidinreductase,ANR)正是在类黄酮物质合成途径中决定这种底物是否转向缩合单宁合成的关键酶。BAN将花青素还原为2,3-顺式-黄酮-醇的功能,随后2,3-顺式-黄酮-3-醇聚合成为缩合单宁。研究甘蓝型油菜及其2个亲本物种的BAN基因有助于进一步研究甘蓝型油菜黄籽性状形成的分子机制,为通过遗传工程创造稳定的甘蓝型黄籽油菜新材料提供基础。
　　 本研究克隆了甘蓝型油菜BAN基因家族(BnBAN)的3个成员、白菜型油菜BAN基因家族(BrBAN)的2个成员和甘蓝BAN基因家族的2个成员(BoBAN)的cDNA序列及其基因组全长序列,并进行了系统分析,主要结果如下:
　　 1)率先克隆了甘蓝型油菜及其2个亲本物种的BAN基因家族本研究利用RACE技术,率先获得了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜型油菜和甘蓝的BAN基因家族部分成员全长cDNA和对应的基因组序列。BnBAN-1、BnBAN-2和BnBAN-3分别为1571bp、1612bp和1574bp,推导的mRNA分别为1178bp、1124bp和1180bp(不计poly(A)尾巴,下同)；BrBAN-1和BrBAN-2分别为1607bp和1623bp,推导的mRNA分别为1212bp和1174bp；BoBAN-1和BoBAN-2分别为1543bp和1642bp,推导的mRNA分别为1172bp和1150bp。这是在芸薹属植物中首次克隆全长BAN基因,为深入研究芸薹属植物BAN基因的功能、进化、调控模式奠定了基础。
　　 2)芸薹属BAN基因具有BAN的典型特征芸薹属7个BAN基因都有5个内含子和6个外显子,符合GT……AG的内含子边界序列特征,并且和AtBAN的位置相符。在BnBAN-1、BnBAN-2、BnBAN-3、BrBAN-1、BrBAN-2、BoBAN-1和BoBAN-2mRNA的41-1069、50-1066、41-1078、74-1111、46-1062、47-1063、41-1069bp区段有分别为1029、1017、1038、1038、1017、1017、1017bp的开放阅读框(ORF,包括终止密码子),5’UTR分别为40、49、40、73、45、46、40bp,3’UTR分别为109、58、102、101、112、87、103bp。分别在它们polyA加尾位点上游的22-42、23-43、22-42、20-39、20-42、15-34、22-45bp有可能的非典型polyA加尾信号TATAAA和AAATAAT。
　　 BnBAN-1、BnBAN-2、BnBAN-3、BrBAN-1、BrBAN-2、BoBAN-1和BoBAN-2分别编码由342、338、345、345、338、342、338个氨基酸组成的多肽链,理论分子量(Mw)分别为37.850、37.680、38.277、38.266、37.614、37.927和37.554,等电点(pI)分别为6.38、4.93、6.38、6.06、5.00、5.81和4.87。它们都编码酸性蛋白,氨基酸组成中丝氨酸的含量均为最高。BnBAN-1、BnBAN-3和BrBAN-1有24个潜在的磷酸化位点,BnBAN-2、BrBAN-2和BoBAN-2都有18个,BoBAN-1有23个。预测它们均没有信号肽和跨膜域,可能象AtBAN一样定位于细胞质中。
　　 芸薹属3个物种的7个BAN蛋白与AtBAN和苜蓿BAN一样,也具有典型的罗斯曼折叠,表现在都具有一个保守的富含谷氨酸的序列GXXGXXA,在该序列中它们均有同已报道的拟南芥中决定BAN底物特异性的氨基酸N21和L22对应的残基,同时在这7个蛋白均存在一个与AtBAN高度相似的亮氨酸拉链。它们的二级结构非常相似,以α螺旋所占比例最高,占氨基酸总数的39.77～42.60％,随机卷曲占30.04

目录

文摘

英文文摘

第1章 文献综述

1.1 甘蓝型油菜及其亲本物种的基本特征

1.2 黄籽油菜种皮特征及研究进展

1.3 类黄酮生物合成途径的研究进展

1.4 花青素还原酶(AN-R)及其BANYULS(BAN)基因研究进展

第2章 引言

第3章 材料与方法

3.1 植物材料、载体和菌种

3.2 试剂和试剂盒

3.3 主要仪器

3.4 基因组DNA的提取

3.5 总RNA的提取

3.6 质粒的提取

3.7 反转录

3.8 引物设计

3.9 目的片断的PCR扩增

3.10 目的片段的克隆与测序

3.11 Southern blot分析

第4章 结果与分析

4.1 核酸提取和生殖器官总cDNA的提取

4.2 BnBAN、BrBAN和BoBAN基因家族各成员的序列克隆

4.3 BnBAN、BrBAN和BoBAN基因家族各成员的核苷酸序列分析

4.4 BnBAN、BrBAN和BoBAN基因家族各成员编码蛋白的分析

4.5 BnBAN基因家族的Southern blot杂交结果

第5章 讨论

5.1 BnBAN、BrBAN、BoBAN家族是拟南芥BAN的垂直同源基因

5.2 关于芸薹属物种中的BAN基因数

5.3 关于甘蓝型油菜与白菜型油菜和甘蓝之间的进化关系

5.4 芸薹属BAN基因的结构特征

第6章 结论

6.1 克隆了甘蓝型油菜及其2个亲本物种的BAN基因家族

6.2 芸薹属BAN基因具有BAN的典型特征

6.3 甘蓝、白菜型油菜为甘蓝型油菜提供了遗传物质

6.4 甘蓝型油菜、白菜型油菜和甘蓝BAN基因家族的成员数

参考文献

缩写词

致谢

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