困难肽AM-55的Fmoc固相合成研究

摘要

固相多肽合成(Solid Phase Peptide Synthesisl)是获取生物活性多肽的一种重要方法，包括Fmoc化学和Boc化学。相对于Boc化学，Fmoc化学满足快速自动化制备的要求，方便快捷，在生化、免疫、分子微生物学及药学等需求多肽较多的领域应用广泛。 虽然Fmoc固相多肽合成技术已经相当成熟，但疏水性氨基酸多且容易出现β折叠等二级结构问题的多肽仍然难以顺利化学合成，一般表现为脱保护和偶联难以完全，缺损肽和截头肽较多，收率很低。这种肽现在称为困难肽。困难肽的合成仍是多肽合成者关注的难点，是目前亟待解决的多肽合成难题之一。 长肽的Fmoc固相合成一般有两种策略：逐步合成法和片段缩合法。前者一般针对长度小于30AA的多肽，后者适合更长的多肽。 我们以一条具有生物活性潜力的超长困难肽AM-55(ATALV ALVFS ILTGS ALGII GYGLL MAVTG ALIDE SLVEK ANKFW GIYST CDFIM)为研究对象，采用Fmoc固相逐步法进行了全肽AM-55的合成，得到了H-IM-45-NH2及其其它更短的多肽；采用Fmoc固相片段缩合合成法合成了该困难肽的一系列片段，并探索了片段肽固相缩合。研究过程中得到如下系列的多肽： H-WM-11-NH2 H-SM-20-OH H-GM-26-NH2H-LM-31-OH H-GM-35-NH2 H-AM-40-OHH-IM-45-NH2 Fmoc-IM-9-OH Fmoc-AG-16-OHFmoc-SG-16-OH Fmoc-AG-14-OH H-IM-9-OHH-AG-16-OH H-SG-16-OH H-AG-14-OH在上述产物的合成过程中，采用Fmoc固相多肽合成法，通过改交树脂及替代度、温度、偶联剂等因素探索了该困难肽的化学合成，比较了各个因素的影响。 在本研究过程中，重点关注了： (1)替代度测定的稳定性问题； (2)树脂及替代度、温度等对逐步合成长序列困难肽的影响； (3)树脂、温度、偶联剂、辅助试剂对困难短肽合成的影响； (4)困难肽的固相片段缩合。 并完成了： (5)WM-11、SM-20、GM-26、LM-31、GM-35、AM-40、IM-45等一系列困难肽的合成，得到了长达45个氨基酸残基的长肽IM-45。 (6)IM-9、AG-16、SG-16、AG-14等4条短的困难肽的Fmoc固相合成。研究结果表明： (7)采用SPPS逐步合成法，长肽AM-55很难合成成功。 (8)Fmoc-IM-9-OH以及IM-9长度短，较易合成，产品纯度高；Fmoc-IM-9-OH也较易进行其它化学修饰。 (9)Fmoc-AG-16-OH、Fmoc-SG-16-OH、Fmoc-AG-14-OH溶解性很差，虽然可以合成，但纯度不高；他们的裂解产物AG-16、SG-16、AG-14，几乎不溶于水和甲醇等，无法进行HPLC纯度检查和纯化。 (10)Fmoc-AG-16-OH、Fmoc-SG-16-OH、Fmoc-AG-14-OH很难进行化学修饰；在我们的实验条件下，它们之间的偶联很难成功。 (11)溶解性是困难肽合成的关键因素；升高温度和加入辅助试剂可以提高合成肽纯度；偶联剂和树脂对短困难肽合成也有一定影响。 (12)采用我们的策略和固相片段缩合法，长肽AM-55很难合成成功。 本研究结果对其它困难肽的合成有借鉴意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

声明

第1章文献综述

1.1 Fmoc固相多扶合成

1.1.1保护氨基酸的选择

1.1.2树脂的选择及第一个氨基酸的固载

1.1.3肽键及肽链的形成

1.1.4多肽的裂解

1.1.5多肽的纯化

1.2困难肽的Fmoc固相合成

1.2.1随机性困难肽的合成

1.2.2非随机性困难肽的合成

1.3片段缩合策略

1.4本课题的研究意义

第2章课题设计

2.1课题设计思想

2.2肽序及简称

2.3合成路线设计

2.3.1困难肽AM-55的Fmoc固相逐步合成设计

2.3.2困难肽AM-55的Fmoc固相片段缩合法合成设计

第3章实验内容

3.1主要仪器药品、常用试剂及基本操作

3.1.1主要仪器

3.1.2主要药品

3.1.3常用试剂的配制

3.1.4基本操作

3.2困难肽AM-55的Fmoc逐步固相合成

3.2.1氨基酸树脂的制备

3.2.2困难肽AM-55的逐步固相合成

3.3困难肽AM-55的Fmoc固相片段缩合法合成

3.3.1氨基酸树脂的制备

3.3.2片段肽的制备

3.3.3片段固相缩合

第4章结果讨论

4.1替代度的测定

4.2困难肽AM-55的Fmoc固相逐步合成

4.2.1困难肽AM-55的Fmoc固相逐步合成结果

4.2.2困难肽AM-55的Fmoc逐步合成结果讨论

4.3困难肽AM-55的Fmoc固相片段缩合法合成

4.3.1四条片段肽Fmoc固相逐步合成结果

4.3.2片段肽Fmoc固相合成结果讨论

4.3.3片段肽的固相缩合

4.4其他工作

4.4.1与AM-55相关的工作

4.4.2其他工作

4.5结论与展望

MALDI-TOF质谱谱图

1困难肽AM-55的Fmoc逐步固相合成质谱图

2困难肽AM-55的四条片段肽Fmoc固相合成质谱图

参考文献

致谢

在学期间所参与工作及成果