天然与人工合成三倍体枇杷基因组变异及其DNA甲基化分析

摘要

杂种优势的利用包括二倍体杂种优势利用、多倍体杂种优势利用和功能基因优势利用。而生物由单倍体向多倍体的转变，是自然界物种进化的必然结果。植物多倍体经常出现一些新的表型，如抗旱、无性生殖、抗病虫、花期、器官体积和生物的变化等，使其更适合自身或农业生产的需要，因此未来的农作物优势利用可能是多倍体水平的杂种优势利用。而三倍体在以收获营养体为目的或可以通过无性繁殖的植物上杂种优势尤其突出。据前人研究，三倍体枇杷在生长势、枝条粗度、叶片大小和厚度、叶片组织结构、花器官及果实特性等方面均表现出较为明显的生长性状杂种优势。 因此，本文以天然与人工合成的三倍体枇杷共13个株系及其亲本为试验材料，采用ISSR、AFLP、GISH和MSAP等分子细胞遗传学和分子生物学分析方法，一方面分析了天然与人工合成的三倍体枇杷在基因组重组和三倍化过程中发生的基因组变异；另一方面则对天然与人工合成的三倍体枇杷基因组DNA甲基化的水平和遗传模式进行了统计分析。期望可以从基因组结构变异及表观遗传变异(DNA甲基化分析)两个方面初步探讨三倍体枇杷杂种优势的形成机理，取得了一定的进展，其主要结果如下： (1)以“解放钟”四倍体和“湖南早熟”二倍体为父母本，进行正反有性杂交人工合成三倍体枇杷材料。由于栽培管理原因，以四倍体为父本、二倍体为母本的试验没有结果；以四倍体为母本、二倍体为父本进行有性杂交，共获得30颗F1代种子，经染色体数目检测，其中9颗为三倍体，其得率为30％，其余种子中存在2株二倍体、3株四倍体和16株非整倍体，其得率分别为6.7％、10％和53.3％。所获得的三倍体F1代初步表现出枝条增粗、叶片增大、叶色浓绿等生长性状杂种优势。 (2)人工合成的三倍体枇杷基因组原位杂交(GISH)分析结果表明：以亲本之一基因组DNA为探针，用另一亲本基因组DNA按探针浓度40倍的比例进行封阻，可以准确区分出杂种体细胞中不同来源的染色体，17条来自父本，34条来自母本，且没有发现明显的染色体结构变异如易位和倒位等。 (3)对6个天然三倍体枇杷及其母本ISSR和AFLP分析结果表明：11条ISSR引物共扩增出条带1540条，平均每条引物扩增出条带140条，其中9对引物扩增得到差异带26条，差异性比例为1.7％。差异条带显示3种类型即条带新增、缺失和亮度增强，分别有11条、13条和2条，出现的频率分别为42.3％、50％和7.7％。各天然三倍体株系与母本的差异类型及位点数有所不同，每个株系产生新增条带1-3条，平均1.83条：条带缺失1-3条，平均2.17条；条带亮度增加仅在A368和A322两株系各发现1个位点存在。各株系与母本差异由大到小的顺序是A368、A322、A35、A348、A369、A313。但总体来说，差异条带占总扩增带数的比例仅为1.7％，相对还是较低，推测三倍体基因组可能主要来源于母本，即可能在三倍体形成过程中，与2n雌配子的形成参与有关。 12对AFLP引物共扩增出2454条带，平均每对引物扩增204.5条。与母本比较，三倍体显示差异条带208条，差异性比例为8.5％。差异条带存在2种类型，即条带的新增及缺失，分别有112条和96条，出现的频率为53.9％及46.1％。与母本差异位点数目由多到少的株系为A369、A348、A35、A368、A322、A313，且均出现了条带新增和缺失位点，新增条带为12-25条，平均18.7条；缺失条带从13条到22条不等，平均为16条。AFLP与ISSR分析的结果相比： ①二者的相同结果是A35与母本之间基因组差异处于6个株系的中间位置，A313与母本之间的差异最小，另外显示A368与A322与母本之间的差异接近，A348与A369也存在同样结果； ②不同的是ISSR分析认为A368与A322与母本之间差异较大，A348与A369较小，而AFLP则正好获得相反的结果，产生这种不一致性的原因与两种分析方法的检测效率和扩增的范围不同有关。由于扩增的总差异性比例较低，可以获得与ISSR相同的推测，即三倍体的形成可能与2n雌配子的形成参与有关。 (4)人工合成三倍体枇杷ISSR和AFLP分析得到以下结果：11对ISSR引物共扩增出条带1989条，平均每条引物扩增出180.8条。与双亲相比较，9对引物扩增产生差异带33条，差异性比例为1.7％。差异类型共分为4种即条带新增、条带缺失、父本遗传与母本遗传，这4种差异类型在三倍体枇杷扩增结果中出现的位点数分别为1、4、9和19个，出现频率分别为3.0％、12.1％、27.3％和57.6％，可见杂种后代基因组与母本更为接近，主要由于母本提供的染色体条数较多，但也出现了双亲均没有的扩增条带证明存在少量的基因组变异。在7个三倍体株系中，与亲本差异较大的为杂种6号和杂种3号，分别存在7个和6个差异位点，二者均出现了不同于双亲的扩增条带，其余5个株系差异位点数目相同，均为4个，且均没有出现条带的新增和缺失情况。 12对引物共扩增出条带3122条，平均每对引物产生条带260.2条，其中差异条带294条，差异性比例9.4％。差异条带共存在4种类型，即新增、缺失、父本遗传和母本遗传，分别存在82、58、49和105个差异位点，出现的频率分别为27.9％、19.7％、16.7％和35.7％。由此可见，人工合成的三倍体枇杷在形成过程中发生了基因组分子水平的变异，扩增时出现了一定比例的条带新增和条带缺失情况。杂种与亲本之间差异位点由多到少的顺序为杂种8号、杂种4号、杂种1号、杂种6号、杂种19号、杂种3号、杂种2号。与ISSR结果进行比较，AFLP在检测的位点数和多态性方面扩增效率更高。 (5)对6个天然三倍体枇杷株系及其母本进行DNA甲基化分析，12对引物扩增总带数为3879条，其中全甲基化带数363条，半甲基化带数241条，甲基化带数共604条，三倍体枇杷各株系总甲基化率(全甲基化和半甲基化)为12.9％-18.3％，平均为15.8％，全甲基化率为7.6％．11.7％，平均9.7％，半甲基化率为4.7％-6.1％，平均为5.6％；二倍体母本株系的总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分别为14.1％、7.7％和6.5％。三倍体株系基因组DNA总甲基化率由高到低依次为A348(18.3％)、A35(17.8％)、A313(16.O％)、A369t(15.7％)、A322(14.3％)、A368(12.9％)，除A368较母本有所降低之外，其它5个天然三倍体株系较其母本均有提高；全甲基化率由高到低分别为．A348(12.5％)、A35(11.7％)、A313(10.1％)、A369(9.9％)、A322(9.6％)、A368(7.6％)，与总甲基化率一样，A368较对照降低，其它株系较对照均有提高；半甲基化率较对照而言，所有三倍体株系均呈现下降趋势，最高是A35，为6.1％，其次是A313、A348和A369，均为5.8％，A368为5.3％，最小是A322，为4.7％。 (6)对7个人工合成的三倍体枇杷及其四倍体与二倍体亲本进行基因组甲基化分析，结果显示12对引物共扩增出条带5302条，其中总甲基化带数838条，全甲基化带数和半甲基化带数分别为605和233条，多态性比例为15.8％。母本的总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分别为17.6％、11.5％和6.2％；父本分别为16.9％、11.1％和5.9％。7个三倍体杂种F1代基因组DNA总甲基化率为13.2％-17.8％，平均为15.4％，全甲基化率为10.5％-12.2％，平均为11.7％，半甲基化率为2.2％-5.5％，平均为3.9％。与双亲进行比较，得到如下结果： (1)三倍体枇杷总甲基化率没有明显的变化趋势，可能升高、降低或介于双亲之间，其中升高的杂种后代为杂种19号(17.8％)；介于双亲之间的是杂种3号(17.6％)；其余均有所降低，为13.2％-16.8％，包括杂种1号、2号、4号、6号和8号。 (2)全甲基化率与总甲基化呈现类似的规律，或升高、降低，或介于双亲之间，但大部分全甲基化率提高，包括杂种1号(11.7％)、3号(13.5％)和19号(12.3％)；其次为降低和介于双亲之间两种情况，分别有2个株系，较双亲降低的是杂种4号(10.9％)和6号(10.5％)，介于双亲之间的是杂种2号(11.5％)与杂种8号(11.4％)。 (3)半甲基化率则呈现出与天然三倍体枇杷一致的结果，即较亲本而言均有降低的趋势，人工合成的三倍体杂种半甲基化率为2.2％-5.5％，均低于双亲的6.2％和5.9％。 7个人工合成三倍体枇杷与其亲本共呈现出51种甲基化变异类型，包含单态性(A1和A2)、去甲基化(B)、过或超甲基化(C)、次甲基化(D)和中间类型(E)，其出现的频率分别为24.2％、28.8％、38.5％、6.6％和1.9％。总体来看，以过或超甲基化遗传变异为主，去甲基化次之，同时伴随有次甲基化、与亲本甲基化状态不变和甲基化状态介于双亲之间等甲基化模式。人工合成三倍体枇杷各株系均存在这5种甲基化类型，位点数由多到少来依次为杂种3号、1号、6号、8号、19号、4号和2号。其中主要存在过或超甲基化类型的株系有杂种3号、1号、8号、19号、4号和2号，而杂种6号同时发生大量的过或超甲基化和去甲基化变异。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略语表

声明

第1章文献综述

1.1多倍体研究进展

1.1.1多倍体概述及研究简史

1.1.2植物多倍体的遗传与表观遗传变异

1.2 DNA甲基化的研究进展

1.2.1 DNA甲基化概述及其特点

1.2.2 DNA甲基化的发生机制

1.2.3 DNA甲基化的遗传和变异

1.2.4 DNA甲基化的生物学意义

1.2.5 DNA甲基化的检测和研究方法

1.3枇杷研究进展

1.3.1枇杷的营养、药用和经济价值

1.3.2三倍体枇杷研究进展

1.3.3分子标记技术在枇杷属中的研究应用

第2章引言

第3章材料与方法

3.1试验材料

3.1.1天然三倍体枇杷材料

3.1.2人工合成三倍体枇杷

3.2试验方法

3.2.1人工合成三倍体枇杷的获得

3.2.2基因组DNA提取

3.2.3杂种F1代基因组原位杂交(GISH)分析

3.2.4简单区间重复序列(ISSR)分析

3.2.5 扩增片段长度多态性（SFLP）及甲基化敏感扩增多态性（MSAP）分析

3.2.7 4％和6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

3.2.8结果分析方法

3.2.9主要试剂配制

第4章结果与分析

4.1枇杷有性杂交获得三倍体F1代

4.1.1四倍体与二倍体正反交结果

4.1.2杂种F1代体细胞染色体数目检测

4.1.3三倍体杂种F1代幼苗生长状况

4.2三倍体枇杷基因组DNA提取

4.3人工合成三倍体枇杷GISH分析

4.4三倍体枇杷ISSR分析

4.4.1 6个天然三倍体枇杷株系ISSR结果

4.4.2人工合成三倍体枇杷基因组DNA的ISSR分析

4.5三倍体枇杷AFLP分析

4.5.1基因组DNA的酶切、连接与预扩增

4.5.2基因组DNA的选择性扩增

4.6三倍体枇杷MSAP分析

4.6.1三倍体枇杷基因组DNA的酶切、连接与预扩增

4.6.2三倍体枇杷基因组DNA的选择性扩增

第5章讨 论

5.1MSAP法分析植物DNA甲基化的可行性及三倍体枇杷基因组DNA甲基化水平

5.2不同甲基化类型的归类及枇杷基因组DNA甲基化的遗传与变异

5.3三倍体枇杷杂种优势与基因组DNA甲基化

5.4 ISSR和AFLP标记分析天然与人工合成三倍体枇杷基因组差异

5.4.1 ISSR和AFLP标记分析植物基因组差异

5.4.2天然与人工合成三倍体枇杷基因组差异分析

5.5 GISH技术鉴定植物杂种基因组组成

5.6 ISSR和AFLP用于枇杷不同株系分子鉴定的可行性

5.6论文的创新点及不足

5.6.1论文的创新点

5.6.2论文的不足之处及后续研究

第6章结论

参考文献

在读期间发表论文及参与课题

致谢