耻垢分枝杆菌突变菌株库的建立及耐卷曲霉素突变株的筛选与性质研究

摘要

结核病(Tuberculosis，TB)是一种严重危害人类健康的传染病，其病原菌是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)。目前结核病处于复发期，全世界有将近三分之一，约20亿人感染结核分枝杆菌，其中相当一部分患者是持留菌引发的感染。据世界卫生组织(WHO)统计数据表明，每年死于结核病的人数，超出各类传染病死亡人数的总和，仅2006年一年因结核病死亡的人数就有1.5亿。同时多重耐药结核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)的出现，以及人类免疫缺陷病毒(HIV)的联合感染导致结核病再度在全球成流行趋势，且感染率、发病率和死亡率均居高不下。中国作为一个有着巨大人口压力的发展中国家，其结核病负担也相当严重。 目前临床上使用的一线抗结核药物如异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)和吡嗪酰胺(PZA)均已出现耐药菌，这些药物大部分是上个世纪60年代研发的，一直未得到更新，这就制约了结核病控制进程，尤其近期在非洲人陆发现极端耐药结核分枝杆菌，该病原菌对所有一线抗结核约都耐受。耐药结核分枝杆菌一旦传播开来，人类将面临重大灾难。因此，抗结核二线药物就成为了结核病治疗的生力军。 卷曲霉素因其对耐多药及持留期结核分枝杆菌具有独特的疗效，被临床上确定为理想的二线结核病治疗药物，并且，该抗生素也是开发新的肽类结核病药物的模板。随着卷曲霉素住临床上的应用，耐药菌株陆续被发现。因此，深入研究抗结核二线约物的作用机制、耐药机制，指导临床合理用药，以遏制或减缓结核分枝杆菌对此类药物的耐约性，有效治疗MDR-TB以及因持留期结核分枝杆菌引发的感染迫在眉睫。 转座子突变技术是研究微生物功能基因组学的一项重要技术。为了进一步探索结核分枝杆菌对卷曲霉素的耐药机制，开发约物作川的新靶点，更好地指导临床合理用药，我们采用转座突变技术，以非致病性、快生型耻垢分枝杆菌为模式生物，构建突变菌株库，并利用高浓度卷曲霉素(100 ug/ml)筛选高耐药的突变株，共4株，其耐约药由10 ug/ml提高到200ug/ml。利用PCR技术，克隆4株突变耐药株中已知的卷曲霉素耐药基因(tlyA，rrs)，测序，将序列通过BLAST分析，发现4株突变株中，rrs基因均未发生突变，flyA则由于片段较短，难以分析。囚此，我们又尝试了将突变菌株的基因组酶切自连，转化剑人肠杆菌DH5a，利用卡那霉素筛选携带有转座子中卡那霉素基因的自连质粒，测序，获知转座子侧翼序列。在筛选获得卷曲霉素耐药突变株后，进一步比较了野生型和突变型生长特性、细胞全蛋白表达、细胞壁脂肪酸水平、细菌交义耐药等方面的情况。实验结果初步证明了耻垢分枝杆菌对卷曲霉素的高度耐药性与细菌本身的生理变化相关。为进一步阐明结核分枝杆菌的卷曲霉素耐药机理提供了新的思路，也为临床开发新的检测耐药菌株的方法提供了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章文献综述

1.1卷曲霉素作用机理和耐药机理的功能基因组学研究进展

1.2转座子突变技术在微生物功能基因组研究中的应用进展

第2章绪论

2.1研究目的和意义

2.2研究范围和内容

第3章实验材料与方法

3.1实验材料

3.2实验方法

第4章研究结果与分析

4.1突变库的构建

4.2筛选耐卷曲霉素的突变株

4.3抗性遗传稳定性试验

4.4 已知卷曲霉素耐药基因分析

4.5突变株基因插入位点鉴定

4.6突变株生长曲线测定

4.7突变株全细胞蛋白表达情况

4.8突变株对卷曲霉素的药敏变化

4.9突变株全细胞脂肪酸变化

4.10突变株与野生株偏振同步光散射的差异研究

第5章结论与展望

5.1全文总结

5.2展望

附录

致谢

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