大鼠G-蛋白偶联受体激酶5重组蛋白的表达及ELISA检测

摘要

GRK5是G蛋白偶联受体激酶(GRKs)家族的一个成员,它主要磷酸化生物体中最大的一类跨膜受体G蛋白偶联受体(GPCRs),能够介导受体的失敏,调节信号的转导,在组织分化、疾病发生过程中具有重要的作用。有研究显示GRK5在甲状腺分化癌、高血压、心力衰竭、阿尔默海茨病、帕金森病、记忆功能及药物成瘾中具有非常重要的作用。但对GRK5在这些疾病中的具体作用不是很清楚,已有的研究大都是通过相关的动物模型来探讨GRK5的具体功能。动物模型的优点是:临床上平时不易见到的疾病可用动物随时复制出来、可以严格控制实验条件,增强实验材料的可比性、有助于更全面地认识疾病的本质;缺点是:费时、费力、一个周期较长。基因克隆技术使得真核基因能在原核表达系统中表达,蛋白的纯化也比较容易,这给研究蛋白的功能活性带来了方便。而原核表达具有操作方便、快捷,需时较短,表达量大,适合工业化生产等优点。
　　通过基因克隆技术可将GRK5基因转入原核表达系统中进行表达,并对GRK5蛋白的表达进行检测,并且蛋白的纯化比较方便,这对后续蛋白性质的研究奠定基础。
　　本论文就SD大鼠GRK5在大肠杆菌中的表达进行以下的研究。
　　1、GRK5基因的扩增、克隆和序列分析根据GeneBank数据库公布的SD(Sprague-dawley)大鼠GRK5的基因序列,设计GRK5基因的特异性引物,从SD大鼠组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到GRK5基因,限制性酶双酶切后克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体上,送交测序公司测序,得到GRK5的核苷酸序列,并与GeneBank数据库上公布的SD大鼠GRK5基因序列进行比对,比对结果显示GRK5基因克隆成功。
　　2、GRK5-GST重组蛋白在大肠杆菌E.coli Rosetta-gami(DE3)中的表达及优化将GRK5基因重组到pGEX-4T-1载体上,转化到大肠杆菌E.coli Rosetta-gami(DE3)中诱导表达,在OD600为0.6,IPTG终浓度为0.3mM,37℃,诱导4h,经过SDS-PAGE分析,证实GRK5-GST重组蛋白表达成功。将pGEX-4T-1/GRK5重组载体转化大肠杆菌E.coli Rosetta-gami(DE3)中,进行正交试验优化表达,在IPTG浓度为0.3mM、0.5 mM、0.7 mM、0.9 mM,诱导温度为25℃、28℃、30℃、37℃分别下诱导3h、4h、5h、6h,收菌,超声破碎,经过SDS-PAGE和ELISA分析,表达量没有变化,且表达水平低,这可能是由于多种原因造成的,如:稀有密码子、真核基因在原核表达系统中的表达低等。
　　3、GRK5的ELISA方法检测本实验中,GRK5的样品与包被液按1:2的比例稀释;GRK5多克隆抗体按1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000比例的浓度稀释,优化一抗工作浓度;HRP标记的羊抗兔二抗按说明书推荐的最佳比例1:500的浓度稀释,同时设置空白和阴性对照。正式试验采用GRK5的样品与包被液按1:2的比例,优化的一抗工作浓度1:700,二抗1:500,450nm测吸光值,计算出S/N的值,检测GRK5的表达水平,ELISA结果表明:GRK5蛋白在E.coli Rosetta-gami(DE3)中成功表达。

目录

摘要

Abstract

第1章 文献综述

1.1 G蛋白信号转导系统

1.1.1 G蛋白

1.1.2 GPCRs

1.1.3 GPCRs的失敏效应

1.2 GRKs

1.2.1 GRKs的结构及同源性

1.2.2 GRKs的活性调节与功能

1.2.3 GRKs与疾病

1.3 GRK5

1.3.1 GRK5的结构

1.3.2 GRK5与疾病关系

1.4 展望

第2章 引言

第3章 GRK5的克隆与测序

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.3.1 总RNA的提取与RT-PCR

3.3.2 pBluescript Ⅱ SK(+)/GRK5重组质粒的构建

3.3.3 GRK5测序结果

3.4 讨论

3.4.1 RNA的提取及RT-PCR

3.4.2 GRK5的测序结果分析

第4章 SD大鼠GRK5基因在大肠杆菌中的表达及ELISA检测

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.3.1 pGEX-4T-1/GRK5重组质粒的构建

4.3.2 GRK5-GST融合蛋白在Rosetta-gami(DE3)中表达及优化

4.3.3 ELISA检测结果

4.4 讨论

4.4.1 稀有密码子对蛋白表达的影响

4.4.2 ELISA对GRK5抗原的检测

4.4.3 研究GRK5的意义

第5章 结论与展望

参考文献

致谢

在校期间发表的文章和参加的会议

1.发表的文章

2.参加的会议