香石竹木栓化相关基因苯丙氨酸解氨酶的克隆与表达分析

摘要

香石竹(Dianthus caryophyllus L．)属于石竹科(Caryophyllaceae)石竹属(Dianthus)，又名麝香石竹、康乃馨，为多年生草本植物。由于香石竹花期长、色彩丰富、水养期长，适用于室内插花，形成专业切花栽培品种，是世界四大切花之一，在花卉市场中占有重要地位。对鲜切花而言，切割创伤会诱导花茎切口处木栓化，而疏水性的木栓质在茎基端的形成和沉积必然会阻碍鲜切花对水分的吸收。目前国内外对植物创伤引起的木栓化反应研究很少，且主要是以马铃薯块茎或一些木本植物为材料，而以鲜切花为材料还未见有专门、系统的研究，尤其是对鲜切花采后木栓化相关基因的研究则暂未见文献报道。 本实验采用香石竹为材料，利用RT—PCR与RACE技术，对小栓化相关基因—苯丙氮酸解氨酶进行克隆；利用半定量PCR与实时荧光定量PCR技术分别对香石竹茎末端切割创伤反应后dcPAL基因的表达情况进行分析，进而从分子水平深入探讨鲜切花采后木栓化的发生规律及其调控机制。研究结果如下： 1、通过RT—PCR与RACE技术，获得了香石竹dcPAL1、dcPAL2和dcPAL3基因cDNA全长序列，GenBank登录号分别为：FJ864719、FJ905296、FJ905297。dcPAL1基因全长2397bp，开放阅读框长2121bp，编码706个氨基酸，蛋白质分子量约为76.8KD；dcPAL2基因全长2439bp，开放阅读框长2157bp，编码718个氨基酸，蛋白质分子量约为78.3KD：dcPAL3基因全长2435bp，开放阅读框长2130bp，编码709个氨基酸，蛋白质分子量约为77.0KD。dcPAL1、dcPAl2、dcAPL3 cDNA推导的氨基酸序列中第220和第227个氨基酸均为丝氨酸，这2个丝氨酸是所有已知PAL基因的活性保守何点，此外，p269、K270、E271、G272、L273N277、Y368、N401、H413，这些活性位点与拟南芥和水稻的活性位点非常相似。 2、利用RT—PCR扩增到了dcPAL1的ORF基因片段，EcoRⅠ/HindⅢ双酶切后与pET28载体连接形成原核表达pET28+dcPAL1—ORF重组质粒，后转入大肠杆菌BL21表达宿主细胞。成功诱导重组蛋白表达，诱导条件为：终浓度为1mM的IPTG，37℃振荡培养4h。 3、利用半定量PCR对香石竹茎末端切割创伤后的PAL基因表达分析：dcPAL1在0h有较高的表达，不是因为切割诱导表达，但是它会随着切割后时间变化而发生变化；结合PAL活性的分析结果来看，0h-48h dcPAL2的表达量是逐步增加的，而PAL活性在48h时达到最大的，变化趋势基本吻合，推测切割创伤诱导dcPAL2的表达量增加，从而进一步的在翻译水平上进行调节；dcPAL3基因虽然最初受到创伤的刺激而表达量增加，而后又随着切割后时间变化而发生变化，说明dcPAL3在切割创伤中被诱导表达，也属于诱导表达基因。 4、利用实时荧光定量PCR对香石竹茎末端切割创伤后的PAL基因表达分析：dcPAL1在0h的表达量非常高，说明dcPAL1并不是对香石竹苇末端切割诱导产生的，它产生在切割创伤反应之前；dcPAL2的0h的表达量比较低，随着切割创伤时间的变化，dcPAL2的表达量相应的增加，虽不是逐渐的增加，但是相比0h、1h的表达量来说，增加的最小量也达到了3倍，推测dcPAL2与切割创伤反应关系紧密；dcPAL3的表达量变化幅度比较大，0h-6h dcPAL3的表达量呈现逐渐增加的趋势，可以认为切割创伤反应诱导了dcPAL3的表达，而后表达量降低；在第7天出现了个较大的峰值，其原因有待进一步的研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1木栓化的研究进展

1.2植物苯丙氨酸解氨酶的研究进展

1.3本文研究的目的及意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3结果

3.1 dcPAL1、dcPAL2、dcPAL3全长基因的克隆

3.2 dcPAL1+pET28原核表达载体的构建及重组蛋白纯化

3.3 dcPAL1、dcPAL2、dcPAL3基因的表达分析

4讨论

结论

参考文献

附录：缩略词

致谢

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