用酵母双杂交系统从人睾丸cDNA文库中筛选与蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的研究

摘要

目的：蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞增殖和分化、信号的转导和加工等方面起重要作用。CK2在睾丸及脑组织中活性最高，睾丸组织中CK2α’亚基水平是脑组织的两倍，CK2β亚基比脑组织高3-4倍，比其它组织高将近8-10倍。敲除了小鼠CK2α'亚基的基因Csnk2a2的纯合子鼠，其生殖细胞严重减少并产生圆头精子而导致不育，与人类圆头精子综合症相似。Csnk2a2即CK2α’可能是这种遗传综合症的候选基因。为研究CK2α’亚基在精子发生中的作用机制，本研究拟利用酵母双杂交系统从人睾丸cDNA文库中筛选与蛋白激酶CK2α’亚基相互作用的蛋白。 方法：将构建于pACT2质粒(酵母双杂交中的AD质粒)的人睾丸cDNA文库和本室已成功构建的BD质粒共转染感受态酵母菌AH109。用AD质粒和BD质粒进行酵母双杂交实验，以初步筛选出阳性候选克隆，再对上述筛选的阳性候选克隆进行一对一回复性杂交，最后筛选出真阳性克隆(即与人蛋白激酶CK2α'相互作用的蛋白)。经上述一对一回复确证为阳性相互作用的AD质粒，以pACT2质粒的通用引物为测序引物测定该质粒的插入片段cDNA序列。通过国际互联网络，以美国国立生物信息中心(NCBI)的BLAST作为主要的检索工具，检索主要程序采用BLASTN，对相互作用蛋白的cDNA序列进行同源性分析，最终确定该相互作用蛋白的名称。并用GST-pulldown在细胞外进一步证实蛋白质问的相互作用。 结论：用酵母双杂交系统从人睾丸cDNA文库中筛选出8种与人蛋白激酶CK2α'相互作用的蛋白。人蛋白激酶CK2α’与人转换蛋白1(TP1)在细胞内及细胞外均有相互作用。

目录

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1前言

1.1研究背景

1.2研究目的

1.3研究内容

2用酵母双杂交系统从人睾丸cDNA文库中初步筛选与蛋白激酶CK2 α'相互作用蛋白的候选克隆

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

3相互作用蛋白的进一步确证、cDNA序列测定及其同源性分析

3.1材料与方法

3.2结果

3.2.1酵母质粒抽提物PCR结果

3.2.2阳性候选克隆的分组情况

3.2.3酵母质粒抽提物转化JM109

3.2.3单一文库质粒对AH109自主激活实验

3.2.4一对一回复性杂交实验

3.2.5AD/文库质粒插入片段cDNA序列测定结果及其同源性分析

3.3讨论

4用GST融合蛋白沉降技术检测细胞外蛋白质间的相互作用

4.1材料与方法

4.2方法

4.3结果

4.4讨论

5小结

参考文献

综述：蛋白激酶CK2与精子发生

致谢

附录一缩写词中英文对照

附录二在读硕士期间的科研情况