蜘蛛兰褐斑病及其病原菌鉴定与病害的药剂控制试验

摘要

蜘蛛兰(Hymenocallis littoralis(Jacq．)Salisb，石蒜科Amaryllidaceae)是我国广泛栽培的、具有重要观赏和药用价值的一种二级保护植物。近年来，在其上发现了一种褐斑病，严重的影响了蜘蛛兰的观赏价值和经济价值。查阅现有文献，有关蜘蛛兰这种病害目前国内外尚未见研究报道。本研究通过采集重庆不同地区蜘蛛兰褐斑病病叶标本，进行了组织分离纯化、并经致病性测定、形态学及分子生物学鉴定明确致病菌、病原菌生物学特性研究、药剂的室内毒力测定，以及田间药效试验的研究，以期为制定安全经济有效的病害综合控制策略和技术措施提供科学依据。 蜘蛛兰褐斑病的主要症状及病原菌的分离：该病害主要侵染蜘蛛兰叶片，病斑初期圆形、卵圆形或梭形，外缘有淡黄色晕圈，中部组织死亡呈褐色。随着时间的增长病斑呈现梭形褐色长条大斑，有时几个病斑联合，致使叶片大部分组织枯死。通过组织分离法对褐斑处进行病原菌分离纯化后，得到多个真菌菌株，根据柯赫氏证病律进行致病性测定，判定其中两个菌株为该病的病原物，分别命名为SLD1和SLD2。用这两个菌株分别接种和复合接种后均使蜘蛛兰叶片产生病斑，单独接种引致的病斑略有差异，复合接种的症状与田间植株症状相同，并从接种各发病的组织中再分离得到原来的病原菌，由此最终确认这两个菌株是引起蜘蛛兰褐斑病的病原菌，而蜘蛛兰褐斑病则是这两种病菌复合侵染而致。 蜘蛛兰褐斑病菌的形态学特征与鉴定：菌株SLD1分生孢子盘生于寄主植物表皮下，分散或合生，成熟后不规则开裂，浅盘状，有刚毛，褐色至暗褐色，表面光滑，至顶端渐尖。在PDA培养基上25℃培养菌落圆形，气生菌丝较发达，白色，绒毛状，边缘较整齐，7-8d后，菌落中心表面长出橘红色、具光泽且湿润的分生孢子堆，这使得整个菌落呈淡粉色。分生孢子梗较短，呈栅状排列于分生孢子盘底部，无色至褐色，基部分枝，光滑。分生孢子长椭圆形或短圆柱形，无色，单孢，分生孢子内有1-2个油球，大小为16.0-24.5×4.8-6.0μm。菌丝无色，分隔非常明显，直径约1.2-2.4μm。实验室培养和田间调查未发现该病原菌的有性时期。 菌株SLD2分生孢子盘杯状，散生或集生，初埋生后外露，黑色或暗褐色底层由厚壁、角状、暗褐色细胞构成，盘表面产孢区细胞壁薄，色淡。在PDA培养基上25℃培养5d菌落圆形，气生菌丝较发达，白色，短絮状，呈辐射状扩展，4-5d后菌落表面长出黑色油球状或不规则状、具光泽而湿润的分生孢子堆，呈放射状分布；随培养时间延长，分生孢子堆大量产生，有的在菌落表面联合成片。分生孢子梗较短，着生于分生孢子盘基部，无色或浅褐色，分隔，不规则分枝。分生孢子纺锤形或倒棍棒状，大小为15.6-27.5×4.5-7.6μm，直或稍微弯曲，5个细胞，各细胞之间分隔均为真隔膜，两端细胞壁薄，无色，中间3个细胞呈橄榄褐色；顶部细胞无色，圆锥形，比次顶部细胞直径明显变小，顶端附属丝2-3条，基部细胞无色倒圆锥形，中生式尾毛1根，约为附属丝长度的1/4。菌丝无色，分隔，直径约1.5-2.5μm。实验室培养和田间调查未发现该病原菌的有性时期。 根据上述特征，SLD1和SLD2分别属于刺盘孢属(Colletotrichum)和拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)真菌。 病原菌的分子鉴定：通过聚合酶链式反应(PCR)分别对菌株SLD1和SLD2核糖体DNA内转录间隔区(rDNA ITS)的特异性扩增，得到了长度分别为553bp和586bp的特异性片段(GenBank登录号分别为：GQ119342和GQ119343)，BLAST比对后，明确SLD1的无性时期为盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)，SLD2无性时期为韦斯梅拟盘多毛孢(Pestalotiopsis vismiae)。 病原菌的主要生物学特性：PDA培养基最适SLD1菌株生长，其产孢强度也最大；最适生长温度为25-30℃，最适产孢温度为25℃；该菌在pH7-8范围内可较好地生长，pH10.0最适产孢；该菌对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖三种碳源及牛肉膏、蛋白胨西种氮源利用最好，葡萄糖和牛肉膏上产孢强度大；光照时间对菌丝生长没有影响，但能抑制产孢及孢子萌发；菌丝的致死条件为60℃处理10 min；分生孢子在pH4.0-12.0均可萌发，其最适萌发pH为7.0。 SLD2在PDA培养基上长势最好，PSA培养基上产孢量最大；最适生长温度为25-30℃，最适产孢温度为25℃；该菌在pH6.0时最适生长，其产孢强度也最大；该菌对葡萄糖、乳糖两种碳源及牛肉膏、蛋白胨两种氮源的利用效果最好，葡萄糖和牛肉膏上产孢强度最大；光照时间对菌丝生长没有影响，但利于产孢；菌丝的致死条件为55℃处理10min；分生孢子在HPDA培养基上萌发率最高；pH为6.5时最适孢子萌发。 控制蜘蛛兰褐斑病的药剂筛选：将供试的7种药剂进行室内生物测定，除硫酸链霉素和井岗霉素没有明显抑制作用外，多菌灵、甲基托布津、武夷菌素、代森锰锌和百菌清对两种病原菌都具有抑制作用，其中对SLD1的EC50分别为0.33917、0.82777、7.93466、46.8933和261.82750μg/mL，对SLD2的EC50分别为0.16058、0.39071、3.65280、29.09667和55.54383μg/mL。田间药效结果表明，供试的三种药剂中，多菌灵和甲基托布津1000倍液对蜘蛛兰褐斑病的防效均达到68％-77％，生物农药武夷菌素防效达到50.0％-64.1％，这三种药剂的1000倍液均比2000倍液控病效果好。可见，多菌灵和甲基托布津对蜘蛛兰褐斑病的防效显著，可推荐在蜘蛛兰栽培和实际生产中应用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1蜘蛛兰概述

1.1蜘蛛兰的形念特征及生活习性

1.2蜘蛛兰的观赏价值、药用价值和经济价值

2刺盘孢属(Colletotrichum)真菌及其研究进展

2.1刺盘孢属的划分

2.2刺盘孢属真菌的种级分类

2.3刺盘孢属真菌的生物学特性

2.4刺盘孢属真菌引起病害的发生规律与危害

3拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)真菌及其研究进展

3.1拟盘多毛孢属的划分

3.2拟盘多毛孢属真菌的种级分类

3.3拟盘多毛孢属真菌的生物学特性

3.4拟盘多毛孢属真菌引起病害的发生规律与危害

4植物病害的药剂防治

4.1化学药剂防治

4.2生物药剂防治

5本研究的主要内容

第二章蜘蛛兰褐斑病病原菌的分离及致病性测定

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 SLD1接种侵染

2.2 SLD2接种侵染

2.3两种菌株复合接种侵染

3结论与讨论

第三章蜘蛛兰褐斑病两种病原菌的鉴定

1材料与方法

1.1菌株及培养基

1.2病菌形态学观察与鉴定

1.3病菌的分子鉴定

2结果与分析

2.1病原菌的主要形态学特征

2.2病原菌SLD1和SLD2的rDNA ITS序列PCR扩增结果与病菌鉴定

3结论与讨论

第四章蜘蛛兰褐斑病病原菌生物学特性

1材料与方法

1.1供试材料

1.2实验方法

1.3统计分析方法

2结果与分析

2.1不同培养基上菌落生长状况及产孢量测定

2.2温度对菌落生长状况及产孢量测定

2.3酸碱度对菌落生长状况及产孢量测定

2.4光照时间对菌落生长状况及产孢量测定

2.5碳源对菌落生长状况及产孢量的测定

2.6氮源对菌落生长状况及产孢量的测定

2.7培养基对分生孢子萌发的影响

2.8酸碱度对分生孢子萌发的影响

2.9光照对分生孢子萌发的影响

2.10菌丝致死温度的测定

3结论与讨论

第五章控制蜘蛛兰褐斑病的药剂筛选

1材料与方法

1.1供试材料

1.2试验方法

1.3统计分析方法

2结果与分析

2.1几种杀菌剂室内的粗筛

2.2杀菌剂室内毒力测定

2.3不同浓度杀菌剂对菌落生长状况及产孢量的测定

2.4药剂田间控治效果

3结论与讨论

第六章结论与展望

1结论

2展望

参考文献

附图

致谢

学习期间所发表的论文及参加课题