基于家蚕(Bombyx mori)基因组精细图的第27、28连锁群研究

摘要

家蚕是遗传学研究最为详尽的昆虫之一，然其第27、28连锁群至今尚未建立。本研究在家蚕基因组精细图数据的基础上，利用从序列到表型的研究思路，对家蚕第27、28号染色体进行深入研究。通过整合连锁图谱、填补Gaps、进行基因预测和功能注释、筛查和鉴定第27、28染色体上的基因，推测可能出现的表型，为建立家蚕第27、28连锁群提供新的启迪。 1．家蚕第27、28号染色体遗传图谱的整合 本研究利用覆盖度达到了9倍的家蚕基因组数据集，包括43622条scaffold序列，预测基因14632个。整理利用能与序列信息对应的1577个SNP标记和3000个SSR标记，筛选出位于27染色体的SNP32个，第28号染色体24个，分别将9个和5个基因组片段定位在27、28染色体上。结果显示，这两条染色体上至少分别拥有10．4Mb和10．3Mb的基因组序列。 2．家蚕第27、28号染色体Gaps的填补和验证 家蚕精细图中第27、28号染色体仍存在部分缝隙（Gaps），27号染色体由9个基因组片段构成，其中含有8个Gaps；28号染色体由5个基因组片段构成，其中含有4个Gaps：我们在BAC库中利用perl程序提取BAC末端序列，利用本地BLASTN程序与家蚕9X基因组数据进行比对，以比对分值最高者作为连接Gaps的BAC：同时还发现了有可能是位于27、28号染色体上的“新的”基因组片段，如27号染色体上总长达200kb左右的nscaf2803和nscaf2804；28号染色体上的nscaf3101。 利用生物学软件primer5．0，随机在第27、28号染色体上各选择2个填补的Gaps，在两端的基因组片段末端10kb内非重复序列区设计引物，以填补的BAC为扩增模板，PCR实验验证了生物信息分析的结果。因此，通过对这两条染色体Gaps的填补，为完善第27、28号染色体的DNA序列提供有效的方法和数据，也为家蚕基因组完成图的绘制提供了新内容。 3．家蚕第27、28号染色体基因功能注释 利用生物信息学方法获得了家蚕27、28号染色体预测基因分别为241和288个，蛋白质编码序列（CDS）长度都是2000 bp以下的占绝对优势，分别为各自基因总数的80．19％和87．85％。两条染色体最多的基因长度都是400-800bp，分别是各自总数的22．82％和26．39％，具有高度的一致性。 第27号染色体平均每个基因具有7．7个外显子，远高于家蚕基因平均5．4个，第28号染色体平均5．3个，接近家蚕基因平均数目。特别是27号染色体上BGIBMGA004547基因，具有102个外显子，是目前己知家蚕基因中外显子数目最多的基因。 27号染色体上的基因内含子长度分布范围为49-9992bp，内含子平均长度1121bp（n=1619），其中500-999bp的内含子最多，占到了总数的37．18％。28号染色体的基因内含子长度分布范围为49-9919bp，内含子平均长度1354bp（n=1224），其中500-999bp的内含子最多，占到了总数的34．72％。说明两个基因组内含子都以中小片段为主。2条染色体的内含子平均长度都接近整个家蚕基因组内含子平均长度1289 bp。 GC含量对于特定的研究对象是固定的。第27、28号染色体CDS的GC含量分别是49．72％和46．54％，而27、28号整条染色体序列GC含量分别为38．09％和38．44％，高于家蚕平均GC含量33．8％。CDS高于其本身染色体序列的GC含量，说明基因蛋白质编码区的GC含量要高于非编码区。 蛋白质结构域分析发现27号染色体存在Sugar_tr、MFS_1、zf-C2H2、Ion_trans、BESS、Trypsin和HSP20等76种蛋白质结构域，约占家蚕蛋白质结构域的0．5％：28号染色体具有UDPGT、DUF、Serpin、Trypsin、Homeobox和ig等92种蛋白质结构域，约占家蚕蛋白质结构域的0．6％。 家蚕27、28号染色体上分别有195和227个基因具有芯片探针，这些探针的组织芯片数据分别进行聚类分类。27号染色体的这些基因大致可以分为7个小群，不同群基因在组织表达上存在明显差异。28号染色体组织上调比较明显的有4小群。 4．家蚕糖转运蛋白基因家族的鉴定和分析 在基因预测和注释过程中，发现27号染色体具有一个突出的特点：存在很多的糖转运蛋白（Sugar Transporter，ST）基因。为搞清楚该特点是否对27号染色体的结构研究和突变基因的寻找有帮助，对该家族进行了鉴定分析。将家蚕基因注释中有ST或MFS的基因提取出来共计719个，然后采用BLAST检索、跨膜结构域预测，鉴定了家蚕98个ST基因，约占家蚕全部基因总数的0．7％。其中有56个基因具有ESTs证据，占到了预测基因总数的57％。ST基因有84个能定位到染色体上，27号染色体最多，达到18个。聚类分析表明，ST基因有2类功能比较明确：一类主要是转运葡萄糖和海藻糖等糖类；另一类在转运糖类的同时兼转运有机阳离子。 对27号染色体上的ST基因进行结构分析，发现27号染色体是家蚕中最大的ST串联重复基因簇，在nscaf2797的680kb区域内分布了7个ST基因，在nscaf2800的140kb区域内分布了8个ST基因。ST的跨膜结构2-12个不等。基因芯片表达谱分析表明，27号染色体的ST基因中8个ST基因在幼虫丝腺中表达上调，家蚕吸收营养物质的中肠却只有5个ST基因表达上调。可能与这一时期丝腺迅速增长需要大量的能量物质有关。依据丝腺和中肠发育特点，推测在家蚕中肠的ST基因表达上调除休眠以外的生长期可能是长期的，而在丝腺组织中大量基因表达上调可能是特定时期的特殊现象。 5．家蚕第27、28号染色体预测基因的可能表型 利用家蚕第27、28号染色体上的预测基因与果蝇突变基因序列进行同源比对，获得了家蚕预测的突变基因。依据果蝇突变基因的表型，整理作为家蚕突变基因可能的形态特征。经过同源检索，第27号染色体上有26个预测的突变基因，其中有16个同源果蝇突变基因主要在生殖、发育、变态和形态等方面有明显的表现型；第28号染色体上15个预测突变基因都在果蝇中发现了突变表型。为将来在家蚕资源库利用各种诱变方式收集第27、28号染色体突变的表型，最终发现家蚕27、28连锁群的形态标记提供重要参考。 综合本研究，我们对家蚕的27、28号染色体进行了系统研究，对两条染色体存在可能突变表型的研究，为家蚕连锁图谱的研究提供了新的思路。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1家蚕遗传图谱研究概述

1.2家蚕经典连锁遗传图谱研究进展

1.3家蚕分子标记遗传图谱的研究进展

1.3.1 RFLP分子标记连锁图谱

1.3.2 RAPD分子标记连锁图谱

1.3.3 AFLP分子标记连锁图谱

1.3.4 SSR分子标记连锁图谱

1.3.5 SNP分子标记连锁图谱

1.4家蚕的基因组图谱

1.4.1基因功能注释的研究进展

1.4.2家蚕基因表达研究进展

第二章引言

2.1研究家蚕第27、28号染色体的重要意义

2.2主要研究内容

2.3研究思路与技术路线

第三章家蚕第27、28染色体遗传图谱整合

3.1材料和方法

3.1.1数据来源

3.1.2分子标记收集

3.1.3序列比对

3.2结果与分析

3.2.1利用SNP标记对家蚕第27号染色体进行图谱整合

3.2.2利用SNP标记对家蚕第28号染色体进行图谱整合

3.2.3利用SSR标记对家蚕第27、28号染色体进行图谱整合

3.3讨论

第四章家蚕第27、28号染色体的GAPS填补

4.1材料与方法

4.1.1数据和材料来源

4.1.2信息分析

4.1.3主要试剂及耗材

4.1.4主要溶液及配制

4.1.5主要仪器设备

4.1.6 PCR引物、反应体系和程序的设计

4.2结果与分析

4.2.1未匹配BAC末端序列的获得

4.2.2未匹配BAC的比对和Gaps填补结果

4.2.3对Gaps填补的PCR验证

4.3讨论

第五章 家蚕第27、28号染色体基因的功能注释

5.1材料和方法

5.1.1序列集合及分析方法

5.1.2序列比对

5.1.3基因相关数据的统计

5.1.4蛋白质结构域预测

5.1.5基因芯片表达谱

5.2结果与分析

5.2.1基因的数目

5.2.2基因的长度

5.2.3外显子和内含子

5.2.4.GC含量

5.2.5蛋白编码基因的功能注释

5.2.6基因表达

5.3讨论

5.3.1基因数目的预测

5.3.2内含子

5.3.3 GC含量

5.3.4蛋白编码基因的功能注释

5.3.5基因表达

第六章家蚕糖转运蛋白基因的鉴定分析

6.1材料和方法

6.1.1基因数据集

6.1.2糖转运蛋白基因的鉴定

6.1.3糖转运蛋白基因家族的分析

6.1.4 27号染色体上糖转运蛋白基因序列和表达分析

6.2结果与分析

6.2.1家蚕糖转运蛋白基因家族的鉴定及分析

6.2.2 27号染色体上糖转运蛋白的结构分析

6.2.3 27号染色体上糖转运蛋白基因的表达谱分析

6.3讨论

6.3.1家蚕糖转运蛋白基因家族的鉴定及分析

6.3.2糖转运蛋白的结构和功能

6.3.3 27号染色体上糖转运蛋白基因的表达

第七章家蚕第27、28号染色体突变基因的可能表型

7.1材料和方法

7.1.1数据库和基因组序列

7.1.2同源性检索

7.1.3突变基因的可能表型

7.2结果与分析

7.2.1第27号染色体基因同源检索的结果

7.2.2第28号染色体基因同源检索的结果

7.3讨论

第八章综合和结论

论文的创新

主要参考文献

附录

博士在读期间发表文章和参研课题情况

致谢