不同时程饮水砷暴露对仔鼠学习记忆能力影响及NMDA受体表达变化研究

摘要

砷是一种具有类金属特性的元素，在自然环境中分布广泛，多以化合物的形式存在。伴随着金属矿物的开采、选矿、冶炼以及砷矿物的自然风化，砷以原矿或砷的氧化物形式逸散到周围环境中，对大气、水体、农作物等造成污染。人体摄入被砷污染的水和食品或吸入砷烟尘，除了导致急慢性砷中毒外，还可使多种癌症发病率上升。砷作为一种神经毒物，能够对神经系统产生损害，引起了人们的高度重视。近年来，不少流行病学调查发现长期饮用含砷水的青少年记忆力和注意力下降，儿童语言能力和长期记忆力下降。动物试验结果也显示，砷可以迟滞仔鼠的神经行为和损害其学习记忆能力。 学习记忆能力与人类生命活动紧密相关，中枢神经系统的功能活动受到多方面的影响，其对毒物毒性作用的敏感程度也较其他组织系统更为敏感。谷氨酸是中枢神经系统中含量最高的一种氨基酸，是神经系统中较普遍而强烈的兴奋性神经递质，谷氨酸受体的其中一个亚型N—甲基—D—门冬氨酸(NMDA)受体通道只是在学习记忆过程中才开启，因而被认为是学习记忆中的关键物质。 本课题着重从NMDA受体亚基基因表达、受体亚基蛋白表达等环节，研究NMDA受体与仔鼠发育阶段砷中毒致学习记忆损害间的关系，旨在探明仔鼠发育阶段砷暴露对学习记忆损害的分子机制，为防治砷中毒的危害在细胞与分子水平提供新的干预靶点，为防治砷中毒对青少年的损害提供实验依据。 SPF级雌性SD大鼠于受孕后第0天开始分孕期暴露(受孕0d～仔鼠出生)、哺乳期暴露(仔鼠出生～21d断乳)和全程暴露(受孕0d～仔鼠出生后42d)三组以自由饮水方式给予100mg/L的NaAsO2水溶液，同时设对照组(饮用蒸馏水)。饲养期间观察仔鼠体重变化，记录生理发育指标和神经反射行为指标。仔鼠出生后42d采用Morris水迷宫进行定位航行、空间探索和可视平台3个实验的测试。处死仔鼠组织，采用RT—PCR方法检测NMDA受体亚基mRNA的表达水平，用Western—blot方法检测NMDA受体亚基蛋白表达水平，结果用Quantity one系统统计分析。选取2周龄乳鼠进行海马脑片膜片钳实验，采用全细胞记录法检测砷孵育后海马脑片动作电位和NMDA受体通道电流的变化情况，验证之前的神经行为实验和分子生物实验结果。 哺乳期染砷组和全程染砷组仔鼠从出生后一周起体重明显低于对照组(P＜0.05)，但张耳、开眼、长毛、出牙等生理发育指标与对照组相比差异无统计学意义。在神经行为测试中，全程染砷组仔鼠平面翻正、悬崖回避和负趋地性等指标达标日龄显著长于对照组(P＜0.05)，出现神经行为发育迟缓。 方位水迷宫实验中，哺乳期染砷组仔鼠正确寻找隐蔽平台所需时间显著长于全程染砷组(P＜0.05)，穿越目标区域次数也显著少于全程染砷组(P＜0.05)，其余各组与对照组相比差异不显著。说明哺乳期染砷对仔鼠学习记忆能力有抑制作用，出生后仔鼠摄入一定量的砷后对短时期内对其学习记忆能力有促进作用，这和砷作为动物生长发育必须微量元素有关。 孕期和哺乳期染砷组仔鼠NMDA受体NR2A亚基基因和蛋白表达水平与对照组相比显著下调(P＜0.05)，NR1和NR2B亚基表达水平未受到明显影响。NR1亚基是学习记忆所必须的基础，NR2亚基在学习记忆过程中起着重要的调节作用，NR2A亚基表达受抑可能是孕期和哺乳期染砷损伤仔鼠学习记忆能力的重要分子机制之一。 海马脑片膜片钳实验结果显示，砷孵育后海马组织受刺激所诱导的动作电位以及NMDA受体通道电流都明显减弱，并且随着染砷浓度的增加程度加大。说明砷确实能够造成NMDA受体通道损伤，从而抑制仔鼠的神经行为发育和学习记忆能力。 本研究显示，哺乳期乳汁摄入砷对仔鼠的生长发育和神经行为发育具有较大的抑制作用。哺乳期染砷能够损伤仔鼠的学习记忆能力，但出生后短时期内摄入一定量的砷对仔鼠的学习记忆能力有一定的促进作用，因此仔鼠发育各阶段砷暴露对学习记忆能力的影响还需进一步深入研究。砷损伤仔鼠学习记忆能力过程中NMDA受体NR1、NR2A、NR2B三个亚基中NR2A起着主要的作用，这仅仅是众多分子机制之一，还有待对更多亚基和通路的深入研究才能更全面的了解砷损伤学习记忆的分子机制。由于哺乳期发育阶段对毒物的特殊敏感性，我们应该更重视早期环境砷中毒，对于饮水和乳制品中砷含量应该严格控制，更好的防治砷中毒对青少年的损害。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章 文献综述

1.1砷污染的来源

1.2砷的毒作用

1.3砷在脑中的蓄积

1.4 NMDA受体及其作用

1.4.1 NMDA受体概述

1.4.2 NMDA受体与学习记忆的关系

1.5砷对神经行为的影响

1.6砷对神经系统影响的作用机制

1.6.1砷对脑组织抗氧化系统的影响

1.6.2砷对脑中神经递质及代谢产物的影响

1.6.3砷与神经细胞因子

1.6.4砷与脑细胞凋亡

1.7砷对神经系统影响研究展望

1.8本文研究意义

第2章 引言

2.1立题背景及依据

2.2研究内容

2.2.1动物分组饲养、生理发育指标和神经行为反射指标的观察

2.2.2通过在体(水迷宫实验)和离体(海马脑片膜片钳检测)研究大鼠发育阶段砷暴露与学习记忆能力损害效应的关系

2.2.3用RT-PCR方法、Westerm-blot方法检测砷对NMDA受体通道各亚基基因转录水平和蛋白水平表达的影响

2.3技术路线

第3章材料与方法

3.1试验材料

3.1.1供试动物

3.1.2主要仪器和设备

3.1.3主要试剂及配制

3.2试验方法

3.2.1动物饲养及交配

3.2.2仔鼠体重变化记录

3.2.3仔鼠生理发育指标观测

3.2.4仔鼠神经发射发育指标观测(Zeng H.et al.,2008)

3.2.5海马脑片膜片钳实验

3.2.6 Morris水迷宫实验

3.2.7 NMDA受体各亚基基因表达水平检测(RT-PCR法)

3.2.8 NMDA受体各亚基蛋白表达水平检测(Western-blot法)

3.3数据统计分析方法

第4章 结果与讨论

4.1砷暴露对仔鼠生理发育和神经反射行为发育的影响

4.1.1对仔鼠体重增长的影响

4.1.2对仔鼠脏体系数的影响

4.1.3对仔鼠生理发育和神经反射行为指标的影响

4.2砷暴露对仔鼠学习记忆能力的影响

4.3砷暴露对NMDA受体NR1、NR2和NR、3三个亚基基因表达水平的影响

4.4砷暴露对NMDA受体NR1、NR2和NR、3三个亚基蛋白表达水平的影响

4.5砷暴露对NMDA受体通道的影响

第5章结论与建议

5.1结论

5.2建议

附图

参考文献

致谢

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