提高昆白小鼠二倍体孤雌胚生成效率的激活方式研究

摘要

孤雌胚胎干细胞是一种新的治疗性克隆胚胎干细胞，与体细胞克隆胚胎干细胞相比具有与其来源动物完全相同的组织相容性抗原，可以用以组织细胞的替代疗法，在人医学上应用前景广阔，意义重大。体细胞克隆胚胎干细胞是近年来全世界研究能够用于组织替代治疗无性繁殖途经的热门课题，但是取于患病动物的体细胞是一种隐含有突变基因的分化细胞，不但克隆囊胚生成率很低，而且隐含有突变基因胚胎干细胞的质量也存在问题，与此相比孤雌胚胎干细胞则来源于具端粒酶活性且尚未经历个体分化途经的生殖细胞，理伦上这种来源于生殖细胞的干细胞不存在当代受治疗动物的突变基因。 但目前从孤雌囊胚分离获取孤雌胚胎干细胞的成功率很低，研究表明，孤雌胚胎干细胞的低分离率在很大程度上与孤雌囊胚细胞的染色质倍性有很大关系[1，2]，而孤雌囊胚的染色质倍性又与卵母细胞激活后激活卵的染色质倍性/核型呈正相关[2]。目前研究者都不加选择的应用未知核型来源的囊胚获取干细胞，事实上从理论上分析只有杂合二倍体核型的囊胚细胞与正常胚胎的体细胞核型具有相似的发育潜力，因此孤雌胚胎染色体核型有可能严重影响孤雌囊胚的生成比率和胚胎干细胞的分离筛选效率。然而，孤雌胚胎一旦做了核型分析后将不复存在，很难通过核型分析直接验证何种染色体核型的孤雌胚胎分离提取干细胞的成功率高。但是，从孤雌胚胎不同染色体核型来源于不同激活程度的成熟卵母细胞可知，人工激活卵母细胞的方法对孤雌胚胎染色体核型的生成具有直接的影响。 本研究根据激活卵母细胞的原理，人工选择5种激活方法并对激活的卵母细胞进行染色质倍性观察，通过检测囊胚生成比率，比较不同类型激活卵的孤雌胚胎发育率，通过优选激活方法生产孤雌囊胚，应用杂合二倍体核型比例高的孤雌囊胚分离筛选孤雌胚胎干细胞，旨在探索一条能够有效分离出来用于克隆性治疗目的孤雌胚胎干细胞的孤雌囊胚生成途径。试验总结如下： 试验1：提高昆白小鼠杂合二倍体孤雌囊胚生成比率的孤雌激活方法研究。试验通过5种不同化学方法激活昆白小鼠成熟卵母细胞，在显微操作仪下观察激活卵第二极体是否排出并进行核型分析，旨在研究不同激活方法所得到激活卵的倾向类型，并对不同染色质倍性的激活卵体外培养发育至囊胚，比较其发育率，选择生成二倍体孤雌胚胎效率最佳的孤雌激活方法。结果发现：(1)乙醇及SrCl2单独激活后出现单倍体的比率较高；而乙醇联合6—DMAP以及SrCl2联合CB激活后出现杂合二倍体的比率较高；(2)10％的乙醇单独作用10min，卵母细胞激活率最高，达到63.3％，在激活卵的原核类型上，2-细胞(嵌合单倍体)的比率较高，但随后囊胚的发育率较差(6.7％)；(3)10％的乙醇处理5min，再用2mM6—DMAP处理2h、4h、6h，激活率随时间增长而提高(37.8％，39.7％，75.0％)，作用6h的激活率最高(75.0％)；在激活卵的原核类型上，乙醇联合6—DMAP激活后抑制第二极体排出情况下出现2个原核的杂合二倍体的比率较高，且囊胚的发育率也显著高于乙醇单独激活(16.7％vs6.7％，P＜0.05)；(4)10mM SrCl2单独及联合CB分别作用2h、4h均能有效激活小鼠卵母细胞，单独及联合CB作用4h的激活率最高，两者差异不显著(52.6％vs61.1％，P＞0.05)；在激活卵的原核类型上，SrCl2单独激活后出现单倍体类型的比率较高，而联合CB后出现杂合二倍体的比率较高，且囊胚发育率与SrCl2单独作用相比差异显著(22.7％vs8.1％，P＜0.05)。以上结果表明：采用10mM SrCl2结合5ug/mlCB作用4h的激活方法对昆白小鼠成熟卵母细胞激活后能够有效抑制第二极体排出，获得较多杂合二倍体孤雌胚胎，与单倍体孤雌胚胎相比，其发育形成孤雌囊胚的比率明显提高。 试验2：全胚法和免疫血清法分离昆白小鼠囊胚干细胞效果观察。目的是依据众多已有研究建立比较可靠的分离胚胎干细胞的研究平台，为本研究中孤雌囊胚干细胞的分离鉴定奠定基础。本试验收集13.5d的小鼠胎儿，分离胎儿成纤维细胞MEF。取生长较好的第3代MEF用丝裂霉素处理后铺层于明胶包被的四孔板制备饲养层；收集小鼠3.5d胚龄的囊胚，分别用全胚法和免疫血清法分离ICM，在饲养层上增殖培养，显微操作仪观察并对细胞集落进行AKP染色做初步鉴定。结果发现：(1)冲出80枚囊胚，采用全胚法置于饲养层上。48h后72枚(90％)脱透明带孵出于饲养层贴壁；96h后可见滋养层细胞铺开，有56枚(70％)ICM长出并开始增殖，5d后ICM增殖成柱状，挑出消化离散成细胞团块后5d可见20个类ESc集落，集落形成率为25％(20/80)；(2)冲出78枚囊胚，采用免疫血清法去透明带后用兔抗鼠血清和豚鼠血清溶解滋养层细胞，得到较纯的ICM，24h后ICM贴壁，3d后增殖为柱状，消化离散，4d可见22个类ESc集落，集落形成率为28.2％(22/78)。(3)集落具有典型的ESCs形态，AKP检测为阳性。结果表明：两种方法均能分离得到类ESc集落，其集落形成率差异不显著(25％vs28.2％，P＞0.05)。 试验3：单倍体与二倍体孤雌囊胚干细胞分离的初步研究。根据试验1的结论获得杂合二倍体及单倍体孤雌胚。由试验2可知全胚法和免疫血清法分离类干细胞集落形成率差异不显著，但考虑到孤雌囊胚在体外处理时间过长，胚胎不易穿破透明带使得囊胚的孵化率和贴壁率降低的因素，因此选用免疫血清法分离两种类型的孤雌囊胚干细胞，并采用AKP染色做初步鉴定，旨在比较单倍体孤雌囊胚和二倍体孤雌囊胚分离出类ES细胞集落的差异程度。结果发现：(1)共将316个小鼠卵母细胞孤雌激活，获得二倍体孤雌囊胚68个(囊胚形成率21.5％)，采用免疫血清法分离干细胞，最后出现2个类ES细胞样集落，集落形成率为3％(2/68)；(2)448个卵母细胞得到单倍体孤雌囊胚58个(囊胚形成率12.9％)，采用免疫血清法分离干细胞，最后只出现1个类ES细胞样集落，集落形成率为1.7％(1/58)；(3)集落具有典型的ESCs形态，AKP检测为阳性，说明所得到的类ES细胞样集落具有与胚胎干细胞类似的多能性。结果表明：选择二倍体孤雌囊胚比单倍体孤雌囊胚分离获取类ES细胞集落的比率高(3％vs1.7％)，其集落形成率两者差异不显著(P＞0.05)。 结论：采用10mM SrCl2结合5ug/mlCB作用4h的激活方法对昆白小鼠成熟卵母细胞激活后能够有效抑制第二极体排出，获得较多杂合二倍体孤雌胚胎，与单倍体孤雌胚相比，其发育形成孤雌囊胚的比率明显提高。对二倍体孤雌囊胚采用免疫血清法去除透明带后置于含UF和IGF的胚胎干细胞培养液的饲养层上增殖，可以分离得到类pES细胞集落，其分离效率较单倍体孤雌胚高。因此，在研究使用孤雌胚干细胞作为新的组织细胞替代性治疗途径时，选择10mM SrCl2结合5ug/mlCB作用4h的孤雌激活方法，能够获得较多杂合二倍体孤雌囊胚，并对这种囊胚采用免疫血清法去除透明带后，比较容易分离得到类孤雌胚胎干细胞。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 文献综述

第一章 卵母细胞孤雌激活的研究进展

1.卵母细胞的激活机制

2.卵母细胞激活的方法

3.卵母细胞孤雌激活存在的问题

4.卵母细胞孤雌激活的意义

第二章 胚胎干细胞的研究进展

1.胚胎干细胞的研究概况

2.ES细胞的生物学特性

3.ES细胞的分离培养及ES细胞系的建立

4.ES细胞的应用前景

5.ES细胞研究所面临的挑战

6.小结

第三章 孤雌生殖胚胎干细胞的研究进展

1.孤雌胚的来源

2.孤雌胚胎干细胞的特点及处理方法

3.哺乳类动物孤雌胚胎干细胞系的建立

4.非人灵长类孤雌胚胎干细胞系的建立

5.孤雌胚胎干细胞系分化的多潜能性

6.应用前景

第二部分 试验部分

试验一提高昆白小鼠杂合二倍体孤雌囊胚生成比率的孤雌激活方法研究

引言

材料与方法

试验二全胚法和免疫血清法分离昆白小鼠囊胚干细胞效果观察

引言

材料与方法

试验三单倍体与二倍体孤雌囊胚干细胞分离的初步研究

引言

材料与方法

结论

参考文献

附录

致 谢

附录3发表论文