巴马小型猪粪样双歧益生菌演替变化规律的研究

摘要

本试验选取了我国特色物种资源小型巴马猪4头，同窝出生均为雄性，进行编号后在相同的条件下饲养，饲料为重庆某饲料公司的乳猪配合饲料，连续跟踪取样90天，以期获得小型猪粪样双歧益生菌的演替变化规律。针对巴马小型猪粪样微生物区系的特异性，首先对巴马小型猪粪样微生物区系的核酸提取方法进行了筛选，并对其16SrDNA的PCR扩增进行了组分优化，并通过对变性梯度凝胶反应条件的探索，确定了DGGE的最佳反应条件。整个试验通过应用PCR—DGGE技术对四只巴马小型猪粪样双歧杆菌区系进行聚类分析和粪样菌群区系的多样性研究，发现断奶期菌群区系呈相对不稳定的变化，最后在此基础上建立16SrDNA克隆文库。这些研究可以为深入开展巴马小型猪肠道菌群与人肠道菌群的相似性研究，促进我国特色资源巴马小型猪在微生态学研究中的应用提供了有效数据。 1．粪样双歧杆菌区系的研究有助于对肠道微生态学的了解，PCR—DGGE方法是研究家畜及人粪样双歧杆菌区系的手段之一。对巴马小型猪双歧杆菌区系的研究，有必要对PCR反应中的各组分进行优化。本实验对该体系的条件进行了优化筛选，PCR扩增产物用凝胶成像系统及Quantity One检测，结果表明，由信噪比曲线中得出的各组分的最佳反应浓度为：25ul体系下，DNA模板为20-40ng(15nM)，引物浓度7.5pM，Mg2+(25mM)的加入量为1.5uL；dNTP(10mM)的加入量为2.0uL，在扩增阶段选择35个循环，退火温度提高到58℃有最佳效果。与PCR常规条件相比较可获最佳结果，产物量增加。同时对变性胶的梯度范围进行了多次探索，最后的试验结果认为DGGE变性胶的范围50-80％可取得很好的效果。最后建立了以细菌16SrDNA为基础的分子生物学研究方法，为粪样双歧杆菌区系多样性研究提供了有效的方法。与PCR常规条件相比较可获较好结果，在DGGE上获得的条带较多，结果稳定，适用于巴马小型猪粪样双歧杆菌区系的研究。 2．对四只小型猪粪样双歧杆菌区系的动态跟踪和相似性聚类分析发现个体的差异比较明显，粪样中细菌菌群呈现明显的不稳定状态，在不同的阶段都会有不同的趋势，但是规律性较好的个体中有大致分为三个阶段的趋势。本研究表明在演替动态明显的仔猪中，断奶对双歧杆菌区系的动态变化有较大应激作用；而对演替过程不明显的仔猪，断奶应激也没有明显影响，断奶后迅速建立稳定状态，一个影响因素可能是断奶时间比较晚，动物能很快适应日粮的变化。全文结果也表明，断奶前期动物的粪样双歧杆菌区系相对的稳定性，其后变化很大，断奶行为是粪样中双歧杆菌区系多样性的动态变化的一个重要原因。 3．为研究粪样双歧杆菌区系建立了巴马小型猪粪样细菌的16SrDNA文库，通过克隆测序，与BLAST分析结果显示，在巴马小型猪的90个克隆中，结果中有56个序列分在一个OUT，与Bifidobacterium adolescentis(T)；Bifidobacterium breve有99％的相近性，占到文库的62.2％；14个序列分在一个OUT与Bifidobacterium infantis；Bifidobacterium longum(T)有99％的相近性，占到15.6％；4个序列分在一个OUT与Bifidobacterium animals(T)；Bifidobacterium angulatum(T)相近性达到99％，占到4.4％，对作为实验动物模型的巴马小型猪而言，更多益生菌区系的数据的获得，何种处理方法最佳仍然需要进一步的研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章文献综述

1.1 肠道微生态的研究进展

1.2肠道微生物的研究分析方法

1.2.1 肠道微生物的分离培养技术

1.2.2传统的消化道菌群区系鉴定方法

1.2.3分子生物学的研究方法

1.3分子生物学方法在肠道菌群研究中的应用

1.3.1 总DNA的获取

1.3.2 PCR扩增核细菌糖体基因

1.3.3微生物区系克隆、序列分析及进化树的建立

1.3.4指纹图谱分析

1.3.5 DGGE的原理及优缺点

第2章 引言

第3章材料与方法

3.1 试验材料

3.1.1 试验动物：

3.1.2主要仪器设备

3.1.3主要溶液及试剂的配制

3.2试验方法

3.2.1 取样

3.2.2 DNA的提取

3.3.3 PCR扩增反应

3.4变性梯度凝胶电泳(Denatudng Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)

3.4.1 DGGE的制备

3.4.2 DGGE图谱的多样性分析

3.4.3统计学分析

3.4.4 16SrDNA克隆及插入子的检测及阳性克隆序列分析

第4章试验结果与分析

4.1 DNA浓度结果与分析

4.2 PCR扩增结果与分析

4.2.1 首次PCR产物的检测与分析

4.2.2二次PCR产物的检测与分析

4.3双歧杆菌菌群的演替动态及相似性分析

4.3.1 1号巴马小型猪粪样双歧杆菌菌群的演替动态及相似性分析

4.3.2 2号巴马小型猪粪样双歧杆菌菌群的演替动态及相似性分析

4.3.3 3号巴马小型猪粪样双歧杆菌菌群的演替动态及相似性分析

4.3.4 4号巴马小型猪粪样双歧杆菌菌群的演替动态及相似性分析

4.4序列分析

第5章讨论

第6章全文小结

参考文献

致谢