适体筛选方法及分离方法的探讨

摘要

核酸适体(aptamer)是指从人工构建的随机单链序列中筛选出的能与蛋白质、其他小分子物质、有机离子等等各种配体特异结合的寡核苷酸片段。它是经体外指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选出来的一系列单链寡核苷酸分子，一般由20～80个碱基组成，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。
　　 目前筛选核酸适体的SELEX技术是分子进化工程技术的一种。核酸分子的一级结构上存在着大量不同顺序的寡核苷酸的排列组合。我们可以利用人工化学合成技术把设计好的一定长度的不同排列组合的寡核苷酸都合成出来，构建成一个包含了这一长度寡核苷酸分子所有可能的突变的寡核苷酸文库，这样就可以在实验条件中模拟大自然的进化，有目的地施加选择压力，筛选出符合特定要求的寡核苷酸分子。
　　 采用SELEX方法筛选适体的关键问题是将与靶标结合的ssDNA与未结合的游离ssDNA分离。本研究的主要探讨适体筛选过程中的筛选方法和分离问题。全文分为3部分分别探讨了3种筛选适体的方法和相关的分离方法：
　　 一、胶体金为分离介质的SELEX技术筛选适体：以猪瘟病毒单克隆抗体和促绒毛膜性腺激素(HCG)单克隆抗体为靶标进行适体的筛选，通过12轮筛选，经聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳发现目的寡核苷酸条带丢失。用超滤离心管作为分离介质，继续对HCG单克隆抗体进行适体筛选，经PAGE胶电泳发现在第五轮筛选中的第10次洗液中仍然有核酸条带。
　　 二、硝酸纤维膜(NC)为分离介质的双链DNA文库法：以固定在NC膜上的HCG单克隆抗体为靶标，以随机双链DNA文库为出发库进行核酸适体筛选，经1轮筛选，PAGE电泳有目的寡核苷酸条带，但在对照用的空膜中也出现相同的寡核苷酸条带。
　　 三、变性-复性法：以硝酸纤维膜(NC)和PDFV膜为分离介质，以蛋白酶K为靶标，以硫醇探针作为跟踪检测，通过1轮筛选，在PAGE胶电泳中有目的核酸条带，对照和洗液中没有条带。硫醇探针检测发现在目的核酸及目的核酸的PCR产物存在的条件下，与硫醇探针结合后，能增加荧光素马来酰亚胺的荧光量，而对照的荧光量没有明显的增加。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要缩略表用语

声明

第一章文献综述

1.1适体研究进展

1.1.1核酸适体的特点和优势

1.2核酸适体的筛选方法

1.2.1.SELEX技术

1.2.2快速法

1.3核酸适体筛选中的分离方法

1.3.1毛细管电泳SELEX(CE-SELEX)

1.3.2超滤离心膜作为分离介质分离

1.3.3磁珠、凝胶、微量滴定板等做为固相介质分离

1.3.4硝酸纤维素膜作为分离介质分离

1.4核酸适体筛选分离方法的研究展望

第二章引言

第三章SELEX法筛选猪瘟病毒核酸适体和HCG(促绒毛膜性腺激素)核酸适体

3.1试验材料

3.1.1主要仪器

3.1.2主要材料

3.1.3主要试剂及其配制

3.2试验方法

3.2.1 SELEX试验总流程图

3.2.2 DNA随机文库的构建与引物的合成

3.2.3 EP管的处理

3.2.4 PCR条件

3.2.5胶体金分离介质进行SELEX筛选猪瘟病毒适体及HCG适体

3.2.6超滤离心膜分离介质进行SELEX筛选HCG适体

3.3结果及分析

3.3.1 PCR条件的优化

3.3.2 SELEX筛选结果

3.4讨论

第四章快速法筛选HCG(促绒毛膜性腺激素)核酸适体

4.1试验材料

4.1.1主要仪器

4.1.2主要材料

4.1.3主要试剂及其配制

4.2试验原理

4.3试验方法

4.3.1快速法实验总流程图

4.3.2 DNA随机文库的构建与引物的合成

4.3.3 PCR条件的优化

4.3.4快速法筛选方法

4.4结果及分析

4.5讨论

第五章变性-复性法筛选碱性蛋白酶K核酸适体

5.1试验材料

5.1.1主要仪器

5.1.2主要材料

5.1.3主要试剂及其配制

5.2实验原理

5.3实验方法

5.3.1实验总流程图

5.3.2 DNA随机文库的构建与引物的合成

5.3.3 PCR条件的优化

5.3.4变性-复性筛选方法

5.3.4检测

5.4结果与分析：

5.5讨论：

第六章全文讨论

第七章全文结论

参考文献

致谢

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