紫栗紫威再生体系的建立和遗传转化初探

摘要

紫栗紫威(Purple Majesty'Pennisetum glaucum(L)R.Br.)是禾本科狼尾草属植物，是一种新型的观赏草。随着世界园林绿化的发展，草坪草已不能满足人们的需要，观赏草以其优美的形态、丰富的色彩、良好的适应性，逐渐进入园林景观设计师的视野。紫栗紫威叶片、茎秆和花穗皆为深紫色，花穗呈香蒲状，用于全日强光或部分遮荫的景观环境中，幼苗为绿色，在长出8片叶子后，植株的茎杆和主叶脉首先开始变紫，有很强的观赏性，而且紫栗紫威耐旱、耐高温。但是紫粟紫威不耐低温，16℃以下基本上就不能存活了，因此“紫粟紫威”在春秋基本上就不能再用了。这可能是紫粟紫威最大的应用局限了。本实验通过对紫栗紫威再生体系的建立，以对愈伤组织进行抗寒基因的转入来增强紫栗紫威的抗寒性，从而为紫栗紫威的大量推广应用奠定基础。
　　 1.紫栗紫威再生体系的建立
　　 以紫粟紫威的成熟种子为材料，以N6为基本培养基，初步建立了紫栗紫威的再生体系：种子表面灭菌方式为：先75％乙醇浸泡1 min，然后0.1％升汞浸泡13 min；在附加2.0 mg/L2,4-D，0.3 mg/L6-BA，690mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，3％蔗糖和6g/L卡拉胶的N6培养基中愈伤诱导率最高，达100％；在诱导培养基中添加100 mg/L Vc可以有效抑制愈伤褐化；附加0.1 mg/L6-BA和0.2％活性炭的N6培养基愈伤分化率最高，达90％；生根培养基为附加3％蔗糖和6g/L卡拉胶的1/2 MS培养基。
　　 2.紫栗紫威遗传转化体系的初步研究
　　 以紫栗紫威的愈伤组织作为外植体，并利用根癌农杆菌介导的遗传转化法将腊梅冷适应蛋白基因Cpcor413pml转入紫栗紫威愈伤组织之中，对影响转化效率的因素进行了初步研究，通过GUS基因瞬时表达的检测，探讨了预培养，不同类型侵染液，农杆菌菌液浓度，侵染时间，共培养时间，AS浓度对紫栗紫威愈伤组织转化的影响。结果表明以上因素是农杆菌介导的紫栗紫威遗传转化的重要影响因素。优化后的转化方法为：将紫栗紫威愈伤组织接种到N6+2.0 mg/L2,4-D+0.3 mg/L6-BA+100 mg/LVc+690mg/L脯氨酸+500mg/L水解酪蛋白的培养基中预培养3～5天；将第二次活化后OD600值为1.0的农杆菌菌液离心后收集菌体，加入液体MS+AS100um/L，重悬到OD600值为0.7左右，将预培养后的愈伤组织置于重悬后的菌液中浸染15min，期间不停的振荡，在超净工作台上将侵染后的愈伤组织接种于N6+2.0 mg/L2,4-D+0.3 mg/L6-BA+100 mg/L Vc+690mg/L脯氨酸+500mg/L水解酪蛋白的共培养基中，暗培养3d；取出共培养的愈伤组织用MS+500mg/LCef振荡脱菌30min，再用无菌水冲洗5次以上；无菌滤纸吸干水分后接种到N6+0.1 mg/L6-BA+100 mg/L Vc+0.2％活性炭+690mg/L脯氨酸+500mg/L水解酪蛋白30mg/LG418+200mg/LCef中进行筛选培养；在最优条件下紫栗紫威的GUS瞬时表达率能达到40％。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章文献综述

1.1观赏草简介

1.1.1观赏草的定义

1.1.2观赏草的观赏特性

1.1.3观赏草的生态特性

1.1.4观赏草在国内外的应用现状

1.1.5观赏草应用时应注意的问题

1.2狼尾草的特性及其在园林景观中的应用概况

1.3御谷草在饲料中的应用

1.3.1珍珠粟用作饲料的原因

1.3.2珍珠粟在国内外用作饲料的概况

1.4紫粟紫威简介

1.4.1紫粟紫威的形态特征

1.4.2紫粟紫威的生态特征

1.4.3紫粟紫威的品种价值

1.4.4紫粟紫威在园林景观中的应用

1.5紫栗紫威再生体系的建立概况

1.5.1组织培养简介

1.5.2禾本科植物组织培养的研究概况

1.5.3观赏草组织培养的研究概况

1.6紫栗紫威的遗传转化体系的建立概况

第2章 引言

第3章材料与方法

3.1实验材料

3.1.1植物材料

3.1.2基因与菌株

3.1.3主要仪器设备及试剂

3.1.4常用试剂

3.1.5基本培养基

3.2实验方法

3.2.1培养条件

3.2.2再生体系的建立

3.3遗传转化的方法与条件的研究

3.3.1农杆菌的培养和活化

3.3.2筛选压的确定

3.3.3 G418对不定芽生根的影响

3.3.4头孢霉素抑菌试验

3.3.5转化方法

3.3.6影响农杆菌转化因素的研究

第4章结果与分析

4.1紫栗紫威再生体系的建立

4.1.1不同消毒方式污染率的比较

4.1.2不同培养基愈伤组织诱导率的比较

4.1.3愈伤组织褐化的抑制效果比较

4.1.4不同培养基愈伤组织分化率的比较

4.1.5不定芽的生根结果

4.2遗传转化的方法与条件的研究

4.2.1筛选压的确定

4.2.2 G418对不定芽生根影响的结果

4.2.3农杆菌菌液对Cef浓度敏感性的测定

4.2.4影响农杆菌转化因素的研究

第5章讨论

5.1紫栗紫威再生体系的建立

5.1.1成熟种子的表面灭菌

5.1.2愈伤组织的诱导和分化

5.1.3愈伤组织在继代过程中的褐化现象及其抑制

5.2遗传转化的影响因素

5.2.1预培养对转化效率的影响

5.2.2农杆菌菌液浓度和愈伤浸染时间对转化效率的影响

5.2.3共培养对转化率的影响

5.2.4 AS浓度对转化率的影响

第6章结论

6.1紫栗紫威再生体系的建立

6.2紫栗紫威愈伤组织遗传转化的研究

参考文献

致谢

在校期间发表的文章