甘蓝细胞质雄性不育性对核背景的响应研究

摘要

结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)杂交优势明显,利用细胞质雄性不育系对甘蓝等叶类蔬菜进行育种具有独特的优势。但甘蓝中尚未发现天然细胞质雄性不育系,生产上多通过转育外源不育细胞质获得甘蓝细胞质雄性不育系,研究甘蓝细胞质雄性不育性对核背景的响应特性,探寻不同细胞质不育类型其雄性不育性对核背景的响应特性,对丰富和完善细胞质雄性不育理论和确定选育方向,减少转育工作量有重要意义。
　　 本文以回交转育获得的多组同质异核细胞质雄性不育系为材料,首先利用各类细胞质雄性不育特异的基因鉴定引进不育材料的类型,然后观察各类细胞质雄性不育花器官形态对核背景的响应,而后再对其中三份材料进行多代连续回交转育,获得三组稳定的同质异核雄性不育系。通过石碚切片观察研究了三种不育细胞质花粉败育特征对不同核背景的响应,并利用半定量RT-PCR研究了线粒体上相关基因和花形态建成相关基因在花蕾发育不同阶段的表达情况；同时利用限制性内切酶酶切图谱分析了三种不育细胞质线粒体基因组结构在不同核背景下的变异情况；最后利用聚丙稀酰胺凝胶电泳分析不同核背景ATP、POD同工酶,从同工酶角度研究不同核背景的雄性不育系代谢差异,及细胞质对核基因的反向调控。主要研究结果如下:
　　 (1)国内目前对甘蓝上应用细胞质雄性不育类型缺乏分类鉴定,对各种不育细胞质类型的应用情况尚不明确,不育细胞质类型较为单一。本研究对从国内外多家科研机构引进的15份细胞质雄性不育材料进行鉴定,仅发现1份属于Nap型细胞质不育系,其余14份材料均属于Ogu胞质不育类型。
　　 (2)Nap型细胞质不育材料和两份Ogu细胞质不育材料花器官形态具有较大差异。Nap型细胞质不育材料花瓣呈喇叭状,雄蕊短小退化,花药形态多样,蜜腺退化。第一组Ogu细胞质不育材料花瓣皱缩,雄蕊心皮化,蜜腺退化；第二组Ogu不育花瓣较正常,雄蕊部分退化。Nap型花器官形态对不同核背景的响应表现3种类型,第1类与原材料相近或呈负响应,第2类表现为正响应,第3类花器官不同部位响应不一,呈现正或负响应。Ogu型花器官形态对核背景的响应主要表现为不变化或较弱的正响应。同一自交系对不同来源的不育材料影响的稳定性,因自交系不同而异,对于自交系K1、N4,不同来源胞质材料对其响应趋于一致,对自交系37、F1、G7的响应,在不同来源胞质材料间存在差异。
　　 (3)对Nap型胞质和Ogu型细胞质不育材料花蕾细胞学形态的研究表明,花药以及其中花粉的发育情况受到核背景的影响。Nap型细胞质不育系在不同核背景下败育类型分为无花粉囊分化型和有花粉囊分化型,有花粉囊分化的类型中有部分材料在四分体时期花粉停止发育,还有个别不育材料中四分体可以分离出小孢子,属于花药不开裂导致的雄性不育。第一组Ogu型不育材料花药有心皮化趋势,但是不同核背景下败育特征仍有较大差异,花粉囊分化的情况在不同核背景下表现很不一致。并且,在该组材料普遍雄蕊心皮化的情况下,编号为95材料仍具有较为正常的花药发育。第二组Ogu型不育系败育时期比较稳定,都集中于四分体时期,而花粉囊分化和绒毡层的发育异常方面,在不同核背景下略有差异。
　　 (4)通过对线粒体雄性不育相关候选基因在花蕾发育不同阶段和不同转育核背景下表达的研究,发现Nap型细胞质雄性不育材料中orf222,cox1,atp63个基因的变化趋势基本一致。cox1,atp6以及不育特异基因orf222均受到核背景的影响,在小中大花蕾中表达的规律,三个基因在不同核背景中表现不同,分为前期表达量高后期降低和发育不同阶段表达一致两种类型。这与材料败育特征表现有相关性。orf222,cox1,atp6表达量前期高后期降低的不育材料表现为无花粉囊型败育；而三个基因在花蕾发育过程中表达量稳定的不育材料表现为有花粉囊分化的败育类型。atpA、atp9在不同大小花蕾中和不同核背景下表达量无显著差异,即不受核背景的影响。
　　 Ogu型细胞质雄性不育系相关不育基因的表达则与Nap存在差异,且两类Ogu不育之间也不一致。79＃来源的不育胞质中orf138在不同核背景下表达存在一定的差异,cox1,atp6 atpA、atp9的表达则不受花蕾发育阶段和核背景的影响。
　　 对于99＃来源的第二组Ogu胞质,在orf138、cox1,atp6 atpA,atp95个线粒体基因的表达无明显差异,其表达既不受核背景影响,也不随发育阶段改变而发生变化。
　　 (5)对与花形态建成相关的AP3、PI、AG基因表达分析,表明 AP3、AG在Nap型和Ogu型细胞质不育材料中的表达均表现为不受核背景的影响,并且在花蕾发育的三个阶段表达量保持稳定。但是PI基因在同质异核的不育材料间其表达量表现出了显著变化,推测PI在控制雄性不育系花器官形态发育上有重要作用。
　　 (6)经XhoⅠ、PstⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ四种限制性内切酶对三组不育材料线粒体基因组进行酶切后发现,13份Nap型细胞质同质异核不育材料之间,在四种限制性内切酶酶切图谱中没有差异。但两类ogu型不育中均检测到线粒体结构的变异,第一组Ogu型细胞质线粒体在8个材料中发现有1份材料出现了酶切图谱的变化；第二组Ogu型细胞质线粒体中8个材料中发现了3份不育材料出现了相同的酶切图谱上的变化。线粒体的结构受核背景的影响,并且趋向于在相同的位点发生重排。
　　 (7)对同质异核的不育材料ATP和POD同工酶的分析表明,Nap型细胞质雄性不育材料中ATP同工酶相对保持系,在花蕾发育后期酶活性显著降低,部分材料还表现出谱带的缺失。两组Ogu型细胞质不育材料在花蕾发育不同阶段ATP酶活性基本一致。但在花蕾发育后期同样有部分核背景下表现出谱带的缺失。表明ATP酶在不育材料中的变异程度不同核背景间有一定差异。
　　 编号为93＃和107＃的材料分别属于两组Ogu细胞质雄性不育系材料,两者具有相同的保持系,但是在不同细胞质条件下两者的POD同工酶谱带存在差异,Rf=0.787的酶带存在于93＃中,但在107＃中则缺失。并发现79＃不育系中存在的Rf=0.382的核质互作产生的POD谱带,表明细胞质对POD同工酶组成有调控作用。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写符号及中英文对照表

第一部分 文献综述

1.1 细胞质雄性不育主要类型

1.1.1 黑芥型细胞质雄性不育

1.1.2 甘蓝型油菜细胞质雄性不育

1.1.3 萝卜胞质雄性不育

1.1.4 Tour CMS

1.1.5 其他类型雄性不育

1.2 细胞质雄性不育花器官形态对核背景的响应

1.2.1 核背景对花蕾、开放程度、蜜腺形态变异的影响

1.2.2 核背景对雄蕊、雌蕊形态变异的影响

1.2.3 其他表现

1.3 细胞质雄性不育花粉发育对核背景的响应

1.3.1 正常花粉与细胞质雄性不育花粉发育过程

1.3.2 细胞质雄性不育花粉败育的细胞学特征

1.3.3 细胞质雄性不育败育时期及败育方式

1.3.4 细胞质雄性不育花粉发育对核背景的响应研究进展

1.4 核质互作分子生物学研究进展

1.4.1 植物线粒体基因组概况

1.4.2 线粒体基因组开放阅读框与雄性不育

1.4.3 细胞质雄性不育性对核背景的分子水平响应研究进展

引言

研究背景、目的意义

技术路线

第一章 甘蓝细胞质雄性不育材料分子分型

前言

1.1 材料与方法

1.1.1 实验材料与试剂

1.1.2 实验方法

1.2 结果与分析

1.3 讨论

第二章 甘蓝细胞质雄性不育花器官形态对核背景的响应

前言

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 Nap型细胞质雄性不育花器官形态对不同核背景的响应

2.2.2 Ogu型细胞质雄性不育花器官形态对不同核背景的响应

2.2.3 核背景对不同来源不育系花器官形态的影响

2.3 讨论

第三章 细胞学败育特征对核背景的响应

前言

3.1 材料与试剂

3.1.1 植物材料

3.1.2 试剂与溶液

3.1.3 试验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 正常植株花粉发育

3.2.2 同质异核Nap CMS花粉发育

3.2.3 同质异核OguCMS(79#)花粉发育

3.2.4 同质异核Ogu CMS(99＃)花粉发育

3.3 讨论

第四章 雄性不育相关基因在同质异核不育系中的表达分析

前言

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 不同核背景Nap型细胞质雄性不育相关基因表达

4.2.2 不同核背景Ogu(79#、99#)型细胞质雄性不育相关基因表达

4.3 讨论

第五章 不育系线粒体结构在不同核背景下的变异分析

前言

5.1.材料

5.1.1 植物材料

5.1.2 试剂

5.1.3 主要仪器

5.2 方法

5.2.1 线粒体DNA的提取

5.2.2 线粒体DNA的酶切及电泳分析

5.3 结果与分析

5.3.1 不同核背景Nap CMS不育系线粒体基因组酶切结果

5.3.2 不同核背景Ogu CMS线粒体基因组酶切结果

5.4 讨论

第六章 不同核背景细胞质雄性不育系ATP、POD同工酶分析

前言

6.1 材料

6.1.1 植物材料

6.1.2 试剂

6.2 方法

6.2.1 酶液提取

6.2.2 同工酶电泳

6.2.3 染色方法

6.3 结果与分析

6.3.1 Nap型细胞质雄性不育材料的同工酶分析

6.3.2 Ogu细胞质雄性不育材料的同工酶分析

6.4 讨论

结论

创新点

参考文献

致谢

在学期间发表文章和参加项目情况