家蚕3-dehydroecdysone 3β-reductase基因表达和功能鉴定

摘要

昆虫蜕皮激素(Ecdysone)滴度的周期性变化决定了昆虫的生长和发育[1]。蜕皮激素的生理平衡由其自身的合成与降解控制的。近年来，蜕皮激素合成途径的研究已日益清晰，然而关于其降解代谢途径还研究不多。蜕皮激素代谢主要有两种：直接随昆虫的排泄物排出体外；经过进一步的转化形成非活性的形式[2]。
　　 Koolman(1989)的研究发现在很多昆虫体内，尤其是鳞翅目昆虫，蜕皮激素主要以3-脱氢蜕皮激素(3-dehydroecdysone，3DE)的形式存在。3DE只有很微弱的蜕皮激素活性，因此被认为是昆虫蜕皮激素代谢的一种主要方式[3]。蜕皮激素在蜕皮激素氧化酶(ecdysone oxidase)的作用下转化成3DE，紧接着3DE在依赖NAD(P)H的3-脱氢蜕皮激素-3α还原酶(3-dehydroecdysone-3α-reductase)的不可逆的催化作用下生成3-异构蜕皮激素(3-epiecdysteroid)[4]。
　　 另一方面，血淋巴中的3DE在依赖NAD(P)H的3-脱氢蜕皮激素-3β还原酶(3-dehydroecdysone-3β-reductase)的催化下生成蜕皮激素。前胸腺是昆虫分泌蜕皮激素及3DE的主要器官，之前研究发现3DE与蜕皮激素的比例在不同物种中有很大的差异，而3-脱氢蜕皮激素-3β还原酶作为3DE与蜕皮激素相互转化的酶之一，它对昆虫蜕皮激素滴度的变化可能也起着重要的作用[5]。
　　 随着该途径的发现，3-脱氢蜕皮激素-3β还原酶也从海灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis)以及粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)中纯化出来[5，6]。早在1996年，家蚕的3-dehydroecdysone-3β-reductase就从幼虫的血淋巴中经过六步的纯化得到的，并且在体外分析得到了该酶的酶促动力学参数[7]。然而，至今该基因仍未被鉴定出。
　　 家蚕在作为一种鳞翅目模式昆虫，开始逐步成为基因功能研究的理想材料。随着家蚕基因组和基因芯片数据的公布，也为研究家蚕基因提供了极好的信息平台。本研究在家蚕基因组数据库的基础上，对影响家蚕蜕皮激素形成途径中的基因家蚕3-dehydroecdysone-3β-reductase基因进行了深入系统的研究。主要研究结果如下：
　　 1、基因的生物信息学分析基于NCBI和家蚕基因组数据库，对家蚕Bm3DE-3β-reductase基因进行了生物信息学分析，该基因全长1032 bp，包括8个外显子和7个内含子，编码343个氨基酸，预测蛋白的分子量为39 kDa，等电点(PI)为5.69，位于家蚕第2号染色体的nscaf2053上。经蛋白质结构域分析发现，家蚕(Bm3DE-3β-reductase)与粉纹夜蛾(Tn-3DE-3β-reductase)，海灰翅夜蛾(S1-3DE-3β-reductase)等物种均含有aldo-keto结构域。进化分析表明，Bm3DE-3β-reductase基因与鳞翅目中其他昆虫3DE-3β-reductase基因的进化关系较近。
　　 2、家蚕Bm3DE-3β-reductase基因的表达特征分析RT-PCR表达分析可知，Bm3DE-3β-reductase基因从5龄1天时表达量很低，而到达幼虫5龄7天和上蔟开始时表达最大，上蔟24h之后几乎不表达。Bm3DE-3β-reductase在5龄的表达模式与家蚕的蜕皮时间比较一致，在组织层面上，Bm3DE-3β-reductase基因在头部，表皮，脂肪体，卵巢表达很高，在血淋巴中表达次之。
　　 3、家蚕Bm3DE-3β-reductase基因的原核表达与多克隆抗体制备将Bm3DE-3β-reductase基因中编码第22至343个氨基酸残基的成熟肽基因片段亚克隆到PGEX-4T-1原核表达载体，转化BL21(DE3)诱导表达，并经GST亲和层析纯化靶蛋白，以此为抗原用小鼠制备了抗家蚕Bm3DE-3β-reductase的多克隆抗体。Western blotting检测原核表达的靶蛋白，表明融合蛋白具有家蚕Bm3DE-3β-reductase的抗原性，抗体免疫特异性较高。
　　 4、家蚕Bm3DE-3β-reductase的组织定位利用western blotting检测Bm3DE-3β-reductase基因在蛋白质水平的组织分布情况，结果发现在家蚕脂肪体和血细胞中有很高的表达。进一步，我们通过免疫组化的方法，在这两个组织中探测到了很强的信号，证实了其表达情况。
　　 4.家蚕Bm3DE-3β-reductase基因的真核表达及功能鉴定将Bm3DE-3β-reductase基因中编码第22至343个氨基酸残基的成熟肽基因片段亚克隆到pPIC9K真核表达载体，将重组载体转入酵母X-33中，甲醇诱导表达。Western blotting检测证明目的基因能够在酵母中进行表达。我们利用酵母的表达上清进行功能反应，并用高效液相色谱检测产物的生成，但由于现有底物的问题，其活性的鉴定还需进一步研究。