家蚕3-dehydroecdysone 3β-reductase基因在家蚕免疫体系中的功能分析

摘要

蜕皮激素是昆虫体内最为重要的两类激素之一，它控制着昆虫的生长、发育、繁殖和衰亡。目前，很多研究表明蜕皮激素在昆虫的先天性免疫方面也起着作用，但是蜕皮激素是如何调节昆虫免疫的还并不是十分清楚。不同的研究针对于不同物种得出的结论有所不同，即使对于家蚕的研究，蜕皮激素对免疫系统的影响也不是确定的。另外，前人研究蜕皮激素和昆虫免疫的关系时，均通过体外实验，或者注射外源蜕皮激素来观察对免疫的影响。在受到感染后，昆虫是否会主动调节体内蜕皮激素的滴度，从而影响自身免疫？这项研究还是未知的。本研究以家蚕作为模式探索了蜕皮激素在家蚕免疫体系中的作用，发现家蚕受到外源微生物感染后，体内编码蜕皮激素合成相关酶——3脱氢蜕皮激素3β还原酶(3-dehydroecdysteroid 3β-reductase，3DE-3β-redutase)的基因的表达显著上调，暗示其可能在家蚕免疫中起作用。另外我们通过基因干涉的方法证实了该基因对于免疫的影响。所取得研究结果如下:
　　 (1)当家蚕受到外源微生物感染时，注射一定浓度的20E可以显著提高家蚕的存活率。进一步地，注射FITC标记的细菌实验时，通过显微镜观察到，注射过20E的家蚕的血液样本中细菌数量显著低于没注射过20E的家蚕。以上结果说明，20E能够增强家蚕对外源微生物的清除能力;
　　 (2)在昆虫细胞免疫中，血细胞会在外源物入侵时发生迁移，各类型血细胞发挥作用，如吞噬作用、包囊作用和节结的形成等。因此血细胞迁移的程度反映了细胞免疫的强弱。用不同浓度的20E处理家蚕血液，其血细胞迁移率有明显变化。该结果暗示20E可能通过增强血细胞的迁移，来达到清除外源微生物的作用;
　　 (3)受外源微生物感染后，家蚕蜕皮激素合成基因3DE-3β-reductase基因的表达受到显著上调，说明家蚕有可能通过提高3DE-3β-reductase基因表达来增加体内蜕皮激素的滴度。
　　 (4)在成功干涉家蚕3DE-3β-reductase基因后，注射外源微生物，家蚕的存活率显著低于对照组（未干涉3DE-3β-reductase基因的家蚕），并且在干涉掉家蚕3DE-3β-reductase基因后，大部分家蚕的抗菌肽基因呈下调表达。表明3DE-3β-reductase基因确实能够参与家蚕的免疫体系。
　　 综上所述，我们的结果表明蜕皮激素能够增强家蚕的细胞免疫水平，进而加快家蚕清除体内外源微生物的数量。另外，当家蚕受到外源微生物感染后，家蚕可以增加蜕皮激素合成相关基因3DE-3β-reductase基因的表达，以主动增加体内蜕皮激素的滴度，从而提高家蚕自身的免疫水平。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 昆虫变态发育相关激素的研究

1．1．1 昆虫的蜕皮激素研究

1．1．2 昆虫3DE-3β-redutase的研究

1．1．3 保幼激素和20-羟基蜕皮激素在昆虫先天免疫中的作用

1．2 先天性免疫

1．2．1 体液免疫及其应答

1．2．2 细胞免疫及其应答

第二章 引言

2．1 研究背景及意义

2．2 研究的主要内容

2．3 实验技术路线

第三章 20E增强家蚕的细胞免疫

3．1 20E和病原菌同时注射对存活率的影响

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要仪器

3．1．3 主要试剂

3．1．4 实验步骤

3．2 20E加快家蚕清除病原菌

3．2．1 FITC标记细菌

3．2．2 注射FITC标记细菌及添加20E处理

3．3 20E促进血细胞迁移

3．4 结果与分析

3．4．1 细菌注射及细菌注射同20E处理后家蚕存活率统计

3．4．2 20E对家蚕体内外源微生物的清除作用

3．4．3 家蚕血细胞迁移率统计

3．5 讨论

第四章 家蚕30E-3β-reductase基因干涉及干涉后家蚕的体液免疫反应

4．1 外源微生物诱导后家蚕3DE-3β-redutase基因的表达

4．1．1 材料与试剂

4．1．2 方法和步骤

4．2 3DE-3β-redutase基因干涉后家蚕存活率

4．2．1 材料与试剂

4．2．2 方法和步骤

4．3 3DE-3β-redutase基因干涉后对其它免疫基因的影响

4．4 结果与分析

4．4．1 外源微生物诱导后家蚕3DE-3β-redutase基因的表达

4．4．2 家蚕3DE-3β-redutase基因的干涉

4．4．3 家蚕3DE-3β-redutase基因干涉后存活率统计

4．4．4 家蚕3DE-3β-redutase基因干涉后对其它免疫基因的影响

4．5 讨论

第五章 综合与讨论

参考文献

附录

致谢