家蚕葡萄糖氧化酶基因BmGox的克隆和表达以及序列分析

摘要

葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，GOX)是一种需氧脱氢酶，对生物体无毒，无副作用，能利用葡萄糖氧化成葡萄糖酸而有效除氧。其在动物、植物以及微生物中广泛存在。与真菌GOX相比，有关昆虫GOX性质和功能的研究，显得非常有限。近期研究发现还发现GOX在昆虫与植物相互关系中起着至关重要的作用。
　　 本文主要通过家蚕全基因组序列、基因芯片、EST数据，对家蚕编码葡萄糖氧化酶GOX的两个候选基因Bmgox63和.Bmgox72进行了克隆和原核表达。
　　 获得了以下的结果：
　　 (1)克隆出了家蚕的GOX基因的两个基因，并进行了序列分析。
　　 通过基因序列分析和氨基酸预测，我们得到Bmgox63基因ORF全长1，710bp，编码566个氨基酸，预测蛋白的分子量大小为63kDa，等电点为5.99。Bmgox72基因ORF全长1，830bp，编码606个氨基酸，预测蛋白的分子量大小为65kDa，等电点为5.44。它们位于家蚕的第16号染色体上的nscaf3058。
　　 (2)原核表达了这两个基因获得了大量的蛋白，并正确制备了这两个基因的抗体。
　　 将两个基因编码区亚克隆到pET-28a(+)表达载体，转化到BL21表达菌株，诱导蛋白表达，并纯化蛋白。以纯化的蛋白制备抗体，Western blotting检测到了表达的蛋白，证明抗体制备是正确的。
　　 (3)研究了Bmgox63和Bmgox72这两个基因在家蚕各个组织和时期的表达情况。
　　 通过基因水平的表达谱，Bmgox63其总体的表达量偏低，几乎不表达。Bmgox72基因在家蚕的各个组织和时期中均有或强或弱的表达。其中在时期表达谱中，五龄三天以后的表达量明显升高。组织表达谱发现Bmgox72基因在各个组织中都可以检测得到微量的表达。而在雄性丝腺和雌性丝腺的表达量则明显高于其他组织。通过制备的抗体，从蛋白水平中检测到了这两种基因的表达情况。在蛋白水平上，Bmgox63在家蚕各个组织蛋白中都没有表达；而Bmgox72在丝腺中表达量明显。
　　 通过实验结果，我们推测，Bmgox72就是家蚕的GOX基因，而Bmgox63基因可能在漫长的进化过程中丢失了功能。