牛支原体生长特性及其致病性研究

摘要

牛支原体(Mycoplasma bovis)作为感染牛的一种重要的致病性霉形体，可以引起包括肺炎、乳腺炎、关节炎、生殖道损伤以及结膜炎等在内的多种疾病，同时还可与其他病原协同，造成继发感染。目前，国内外关于牛支原体的研究主要集中在病原的免疫及核酸鉴别诊断方面，国外研究较为深入；国内研究却处于起步阶段，这主要和我国牛支原体流行较晚、规模不大所致。而关于牛支原体病原学特征、致病性及其致病机制的研究报道较少。因此，本课题从牛支原体的生长特性、致病性两个方面，开展了对牛支原体的分离培养、鉴定、生化特性、表性特征、实验动物感染等试验。并采用PCR、CCU颜色改变单位、显微镜检、分光光度法等方法获取实验相关数据，并分析得出牛支原体各分离株生长特性和致病力强弱，筛选出优势流行菌株为后期ELISA诊断试剂盒的开发、疫苗的研制提供参考依。为进一步预防和控制牛支原体及其支原体病奠定理论基础。
　　 1、牛支原体分离、培养及其鉴定
　　 本试验采用改良的支原体培养基对4个省市5个肉牛场中呼吸道症状较重的病牛或死牛的肺脏进行病原分离、培养及纯化，并通过PCR鉴定为牛支原体(Mycoplasma bovis，牛支原体)。改良的液体培养基比较适合牛支原体的生长繁殖，培养时间相对减少，尤其在传代培养时，平均变色时间仅需24h左右。同时，建立的牛支原体PCR检测方法具有特异性较好、灵敏度较高、且操作简单等特点，其检测结果可以作为临床疾病诊断的参考依据。
　　 2、牛支原体生长特性研究
　　 采用已纯化鉴定的6个牛支原体分离株(W70株、1738株、Q1株、Q3株、JX02株、677株)，进行生长特性研究。采用革兰氏、姬母萨、迪那氏染色对菌体和菌落进行形态特征的观察。结果表明：革兰氏染色红色，姬母萨染色紫蓝色；菌体均表现为多形性，以球状和短杆状为主。显微镜检，菌落呈典型的“油煎蛋样”，姬母萨、迪那氏着色效果较好。通过葡萄糖发酵、精氨酸发酵等生化反应观察6个牛支原体分离株纯培养物的生化特性。结果表明：牛支原体属非发酵类支原体。生长过程中，不能利用大多数的糖、精氨酸以及尿素，但可以利用乳糖。采用分光光度法，入射波长为630nm绘制牛支原体生长周期曲线；“三点法”测定生长中pH变化。结果表明：随着培养时间的累积，pH值逐渐下降，且以48h内降幅较大；与此同时，随着时间的累积，菌液OD值逐渐升高，且同样以48h内增幅最大。表明各牛支原体分离在培养48h左右菌体生长可能到达最大限度。
　　 本试验采用浓度为1010CCU/ml的6个牛支原体分离株菌液纯培养物，对7日龄健康鸡胚和6-8周龄SPF级BALB/c小鼠进行感染攻毒实验。鸡胚攻毒实验表明：牛支原体在鸡胚上生长良好，且可造成鸡胚的大量死亡；充血和出血现象较为明显。不同接种方式、不同牛支原体分离株对鸡胚致死作用差异显著(P<0.05)。不同牛支原体分离株对鸡胚致死作用差异显著(P<0.05)，以W70株、1738株致死率较高，Q1株、Q3株次之，677株死亡率最低。BABL/c小鼠感染后，虽然出现增重抑制，脾指数、肺指数上升的异常变化；但是，在攻毒时与攻毒后，均未出现临床呼吸道疾病症状和肺部病理损伤变化，并经病原学分离鉴定未发现牛支原体生长。
　　 综上所述，在牛支原体的实验室微生物诊断中，可以参考本试验所改良的牛支原体分离培养基及其PCR鉴定程序，作为病原分离和疾病诊断的方法；同时，牛支原体在48h左右即可达到对数生长期，在菌种保存或、菌株复壮、增菌扩培时可作为参考依据；在牛支原体的致病性研究中，可参考本实验所选用的健康鸡胚，作为疾病病理研究动物模型；BABL/c小鼠的建模还需进一步研究；与此同时，初步筛选出致病力较强的W70株、1738株、Q3株以及Q1株，可作为ELISA抗原包被、以及多抗疫苗制备的候选株。