丹参骨宝颗粒的制备及其对去卵巢大鼠骨质疏松的预防作用

摘要

目的：
　　 1.确定丹参水溶性有效成分的最佳提取工艺,并将提取液经过一系列过程制备成中药制剂,即丹参骨宝颗粒。
　　 2.建立去卵巢大鼠骨质疏松模型,并观察丹参骨宝颗粒对去卵巢大鼠骨质丢失的预防作用。
　　 方法：
　　 1.建立可同时测定样品中丹参素、丹酚酸B含量的高效液相色谱法,并进行方法学验证,包括精密度、重复性、稳定性、加样回收率等;研究提取方法、提取温度、时间、溶剂对丹参中丹参素、丹酚酸B溶出的影响;以丹参素钠与丹酚酸B含量之比作为评价指标,对溶剂(A)、溶剂量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)等4个因素的3个水平进行L9(34)正交试验优选丹参骨宝酸提取工艺的最佳条件;对最佳工艺条件进行放大试验,验证各工艺条件;研究浓缩过程中pH对丹参素、丹酚酸B含量的影响,确定最佳pH;制备一批丹参骨宝提取液,调pH后适当浓缩,进行喷雾干燥,制备丹参骨宝原料药;将原料药与适量辅料混合,用酒精制备软材,过筛,制粒,整粒即得丹参骨宝颗粒。
　　 2.10月龄未受孕雌性SD大鼠64只,随机分成8组,每组8只。基础组(Bas)未用药,在实验开始即处死;假手术(Sham)组每日给予蒸馏水5ml·kg-1·d-1灌胃,假手术+丹参骨宝(S+DL)组每日给予丹参骨宝颗粒水溶液相当于含丹参素、丹酚酸B共计5mg·kg-1·d-1灌胃,去卵巢模型(OVX)组每同给予蒸馏水55ml·kg-1·d-1灌胃,去卵巢+己烯雌酚(DES)组每日给予己烯雌酚混悬液30μg·kg-1·d-1灌胃,去卵巢+丹参骨宝低剂量(DGG L)组每日给予丹参骨宝颗粒水溶液相当于含丹参素、丹酚酸B共计5mg·kg-1·d-1灌胃,去卵巢+丹参骨宝高剂量组(DGG H)每日给予丹参骨宝颗粒水溶液相当于含丹参素、丹酚酸B共计10mg·kg-1·d-1灌胃,去卵巢联合用药组(DEL+DL)每日给予己烯雌酚混悬液15μg·kg-1·d-1+丹参骨宝颗粒水溶液相当于含丹参素、丹酚酸B共计5mg·kg-1·d-1灌胃。给药时间为12w。所有动物在实验结束前第14d、13d及第4d、3d各行颈部皮下注射钙黄绿素进行两次荧光标记。用药结束后心脏抽血处死大鼠,取血清行生化指标检测,取肝脏、子宫、肾脏、脾、肾上腺等计算器官指数,取右侧胫骨不脱钙,行松质骨的骨形态计量学参数测量,取右侧股骨进行骨生物力学及骨密度检测。
　　 结果：
　　 1.丹参骨宝颗粒的制备
　　 (1)同时测定样品中丹参素、丹酚酸B含量的高效液相色谱法经方法学验证,方法合理,结果可信;(2)确定了采用煎煮法提取丹参水溶性成分,并确定了影响丹参素、丹酚酸B溶出的四个因素:温度、时间、溶剂、煎煮次数;(3)直观分析和方差分析显示酸提取工艺因素的影响大小依次是:溶剂＞溶剂量＞提取时间＞提取次数,最佳提取工艺条件为A3B2C1D3,即5g丹参粗粉加50m10.48mol·L-1。盐酸提取0.5h,共提取3次;(4)最佳工艺经放大试验验证确实可行后,提取一批丹参骨宝提取液,用2.5MNa2CO3调pH为5经喷雾干燥制备共制得棕灰色粉末状丹参骨宝原料药502g,其中丹参素含量为8.02mg·g-1,丹酚酸B含量为10.9mg·g-1。向丹参骨宝原料药中添加适量辅料制备软材,过筛,制粒即得丹参骨宝颗粒,共569g,其中丹参素含量为7.0mg·g-1,丹酚酸B含量为9.4mg·g-1。该方法提取的丹参水溶性成分丹参素和丹酚酸B的比例约1:1。
　　 2.丹参骨宝颗粒及己烯雌酚对去卵巢大鼠骨质疏松的预防作用与Sham组比较,OVX组股骨全部、股骨近端及远端所测得的骨密度均显著降低,并有统计学意义(P＜0.05);最大载荷、弹性载荷、断裂载荷均显著降低(P＜0.001);胫骨上段松质骨静态参数显示,OVX组骨小梁面积和骨小梁厚度较Sham组显著下降,其中大鼠胫骨上段松质骨骨小梁面积百分数比Sham组下降71％(P＜0.001),骨小梁厚度下降23%(P＜0.01),而骨小梁分离度(Tb.Sp)显著增加,并具有统计学意义。
　　 DGG L(5mg·kg-1·d-1)、DGG H(10mg·kg-1·d-1)组的大鼠股骨全部及股骨远近端骨密度显著高于OVX组,均有显著性差异(P＜0.001),但是均未恢复到Sham组水平。DGG H、DEL+DL组能明显提高OVX后大鼠股骨力学的刚度系数及弹性模量(P＜0.01)。而DGG L仅能提高去卵巢大鼠股骨的刚度系数,而对弹性模量增加无影响(P＞0.05)。DGG L、DGG H均可对抗去卵巢导致的大鼠胫骨上段松质骨骨小梁面积百分数(%Tb.Ar)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)的降低。DGG L组大鼠骨小梁面积百分数(%Tb.Ar)是OVX组的162%(P＜0.01)。DGG H组大鼠骨小梁面积百分数(%Tb.Ar)是OVX组的176%(P＜0.01),骨小梁厚度(Tb.Th)是OVX组的120%(P＜0.01)。并且DGG L、DGG H组大鼠的骨小梁分离度(Tb.Sp)较OVX组均显著下降,具有统计学意义。但是与假手术组比较,骨小梁面积百分数(%Tb.Ar)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)偏低,骨小梁分离度(Tb.Sp)偏高,各静态参数指标均未达到Sham组水平。DEL+DL组与DES组比较,其抗骨质疏松作用略微增强,但统计学显示没有显著性差别。
　　 本实验的阳性对照药物30μg·kg-1·d-1的己烯雌酚混悬液可使去卵巢大鼠骨量显著增加,骨生物力学参数、骨密度明显升高,但各参数未达到Sham组水平
　　 对子宫湿重的观察表明已烯雌酚对去卵巢大鼠的子宫有明显的刺激作用,使去卵巢后的子宫重量比增加了171.7%,提示已烯雌酚在预防去卵巢大鼠骨质疏松时伴有明显的对子宫刺激的不良作用。而DGG L、DGG H组大鼠子宫重量无明显改变,提示该药物对子宫无明显的刺激作用。
　　 结论：
　　 1.本研究确定了影响丹参骨宝提取工艺的因素,证明酸提取法可获得丹参素、丹酚酸B含量比为1:1的提取液。经HPLC含量测定,由酸提取液制备得到的丹参骨宝颗粒分别含有丹参素、丹酚酸B7.0mg·g-1、9.4mg·g-1,二者含量之比接近1:1。
　　 2.在本次研究中,去卵巢大鼠松质骨呈现高转换骨质疏松状态。骨形态计量学结果显示,10月龄雌性大鼠去卵巢后骨量明显减少,伴随骨吸收和骨形成同时增加,呈现高转换骨质疏松状态,显示典型的去卵巢骨质疏松模型的改变。
　　 3.本研究研制的丹参骨宝颗粒,能够部分预防去卵巢致大鼠骨质疏松,其作用表现在:丹参骨宝颗粒可增加大鼠松质骨骨小梁面积百分数,骨小梁厚度及骨小梁数量,降低了骨小梁分离度,增加骨密度,增加生物力学最大载荷等。丹参骨宝颗粒对子宫无刺激作用,我们认为丹参骨宝颗粒在预防去卵巢骨质疏松中有雌激素类药物不能替代的优点,可能是治疗绝经后骨质疏松的理想药物。