柑橘杂种胚组织培养挽救及分子标记早期鉴定技术研究

摘要

柑橘杂交育种是培育优良柑橘品种的主要方法之一。但由于绝大多数柑橘品种存在珠心胚现象,杂交后常常引起杂种胚退化或者败育,限制了很多具有优良性状的多胚性品种为亲本的杂交育种。杂种鉴定方面,传统的形态鉴别法、同工酶鉴别法等方法,不适合在胚早期进行杂种鉴定。DNA分子标记技术在杂种胚鉴定上优势明显,可在杂种胚发育早期进行鉴定,并具有准确性和可信度高等优点。因此建立一种高效的杂种胚挽救和鉴定方法,可在一定程度上克服珠心胚现象对杂交育种的干扰,对提高柑橘杂交育种效率、缩短育种周期具有重要意义。
　　 本研究以锦橙×红橘和红橘×锦橙杂交组合为研究对象,首先明确了珠心胚入侵时间,确定进行胚挽救的最佳时间。离体诱导成胚后,应用DNA微量提取技术,提取胚材料DNA,利用SSR分子标记技术进行杂种胚鉴定,从而建立一种高效的杂种胚挽救和鉴定方法,主要结果如下:
　　 1.最佳离体培养时间。
　　 在杂交授粉55 d后,每隔5 d在显微镜下观察胚胎的发育情况,确定珠心胚开始入侵胚囊的时间。当观察到胚囊中开始有胚形成时,每隔5 d取幼胚进行离体培养,通过观察离体培养胚的发育情况,确定进行胚挽救的最佳时间。研究结果表明,对于锦橙×红橘和红橘×锦橙杂交组合,进行杂种胚挽救的最佳时间分别为授粉后85 d和90 d。
　　 2.用于SSR分析所需胚材料最少取样量确定。
　　 利用CTAB法,对不同量胚材料(20 mg,10 mg,5 mg)提取DNA进行SSR分析。结果表明,仅用5 mg胚材料就能提取足够用于SSR分析的基因组DNA,适合于杂种胚早期分子鉴定。
　　 3.多态性引物筛选。
　　 分别以红橘和锦橙DNA为模板,从20对引物中筛选可用于杂种胚早期鉴定的SSR引物。结果表明,引物SS4、Cssr036和Cssr051适用于锦橙×红橘杂种胚的SSR鉴定;而引物SS16、Cssr037和Cssr051适用于红橘×锦橙杂种胚的SSR鉴定。
　　 4.杂种胚鉴定。
　　 以最小取样量分别切取离体培养胚材料,利用筛选的SSR引物和优化的PCR反应条件对培养获得的胚材料进行SSR分析,从46个锦橙×红橘的离体胚挽救材料中筛选出9个杂种胚,从32个红橘×锦橙的离体胚挽救材料中中筛选出7个杂种胚。
　　 综上所述,本研究通过显微镜观察授粉后胚胎发育情况和离体培养胚的生长情况,确定杂种胚挽救的最佳时间,结合DNA微量提取和SSR分子标记技术,可在胚发育早期完成杂种胚的鉴定,大大提高了柑橘杂交育种效率。

目录

文摘

英文文摘

第1章 文献综述

1.1 柑橘产业概况

1.2 国内外柑橘育种进展

1.2.1 杂交育种

1.2.2 芽变选种

1.2.3 诱变育种

1.2.4 细胞工程育种

1.2.5 基因工程育种

1.3 杂种胚挽救

1.3.1 适宜的离体培养时间

1.3.2 离体培养所用培养基、激素和其他营养元素

1.3.3 培养条件

1.4 杂种的鉴定

1.4.1 形态鉴别法

1.4.2 生化鉴别法

1.4.3 细胞学标记

1.4.4 分子标记技术

第2章 引言

2.1 研究背景及意义

2.2 技术路线

第3章 实验材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 常用试剂和主要实验仪器

3.1.3 常用溶液配方

3.2 方法

3.2.1 杂交授粉

3.2.2 离体培养时间的确定

3.2.3 胚挽救

3.2.4 杂种胚分子标记早期鉴定

3.2.5 杂种苗再生

第4章 结果与分析

4.1 杂交授粉

4.2 离体胚培养挽救时间的确定

4.3 引物的筛选

4.4 用于SSR分析所需胚材料取样量确定

4.5 SSR-PCR反应体系的优化

4.6 杂种胚鉴定

4.7 离体培养及杂种胚鉴定结果分析

4.8 杂种胚再生

第5章 讨论

5.1 确定最佳胚挽救的时间对杂种胚挽救的影响

5.2 SSR分子标记鉴定在杂种胚早期鉴定上的优势

5.3 DNA微量提取在杂种胚早期鉴定上的重要作用

5.4 杂种胚挽救和分子标记早期鉴定技术

第6章 小结

参考文献

致谢

发表文章与参加项目