紫肉甘薯花色素苷生物合成相关转录因子克隆与功能分析

摘要

紫肉甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)是一种薯皮为紫黑色、肉质为紫红色的甘薯类型,属于旋花科甘薯属蔓生习性草本植物。紫肉甘薯块根中紫皮和紫肉均可食用,食味甘而甜,纤维少,口感较好,富含淀粉、维生素、氨基酸等多种营养成分,其提取物具有抗坏血酸、抗癌、抗高血糖、抗动脉粥样硬化、抗突变、抗菌作用等多种药理作用。这些药理作用大部分都与紫肉甘薯中富含的花色素苷有关。紫肉甘薯中花色素苷含量为20-180 mg/100 g鲜重。紫肉甘薯块根中浸提的花色素苷是优质天然花色素苷,可以替代人工合成色素,在食品、医药、化妆品方面有着较大应用潜力。
　　 花色素苷是水溶性黄酮类色素中最重要的一类,是花色素与各种单糖通过糖苷键形成的糖基化衍生物总称,属于植物次生代谢产物.花色素苷经苯丙氨酸合成途径和类黄酮生物合成途径合成,生物合成途径需一系列酶催化和转录因子调控.花色素苷合成途径调控主要是受R2R3-MYB类、bHLH类和WD40类转录因子的调控,且一般是由MYB、bHLH和WD40蛋白形成蛋白复合体,直接调控结构基因转录。为研究紫肉甘薯中花色素苷生物合成途径中的调控机理,为花色素苷次生代谢工程提供新靶点,本研究采用RACE技术首次从渝紫263中克隆出来自MYB、bHLH和WD40家族与花色素苷合成相关的5个基因,并进行生物信息学分析。此外,还采用HPLC和比色法对渝紫263各组织中花色素苷含量进行分析。
　　 MYB类转录因子家族相关基因的调节活性是自然界中植物着色模式多变的主要原因,R2R3MYB家族与类黄酮和花色素苷生物合成途径调控紧密相关。本研究采用RACE技术,克隆渝紫263中R2R3MYB家族的一个基因的全长cDNA,并命名为IbMYB1(GenBank登录号为:JQ337861)。生物信息学分析表明,IbMYB1基因的cDNA全长1198 bp(不含ployA),包含长度为750 bp的编码框,长为184 bp的5'-端非翻译区和长为164 bp的3'-端非翻译区。预测结果表明IbMYB1基因编码249个氨基酸的蛋白质,该蛋白质分子量大小为28.6kDa,等电点(pI)为8.57,为碱性蛋白,包含36.55%的α-螺旋、8.03%的延伸链、4.42%的β-转角和51.0%不规则卷曲。氨基酸序列的多重比对表明,IbMYB1与植物中已鉴定的R2R3MYB转录因子序列保守区主要存在于N-端R2R3 DNA结合结构域,其C-端相在各物种间相似性很低。三级结构预测也显示IbMYB1三级结构只在R2R3区域建模成功,与鸡MYB蛋白的R2R3结构域(1A5J)类似,R2和R3结构域分别由2个和3个α-螺旋组成。将IbMYB1与其它植物中MYB类转录因子进行进化树构建分析表明,IbMYB1与大多数已鉴定调控花色索苷生物合成的MYB转录因子聚为一支。采用荧光定量PCR对IbMYB1进行在渝紫263组织表达谱分析结果表明在块根中表达量最高,其次是直径0.5 cm块根(Φ0.5块根)、外周皮、茎节、茎间、叶柄、须根、叶和幼茎尖.
　　 bHLH类转录因子能够识别花色素合成途径中关键酶基因启动子区域的E-BOX(CANNTG)。其与DNA结合时,通常需要两个不同bHLH转录因子形成二聚体才能完成。本研究通过RACE技术,从渝紫263中成功克隆bHLH家族中的两个基因,分别命名为IbbHLH1和IbbHLH2,登录号为分别:JQ337862和JQ337863。生物信息学分析表明,IbbHLH1基因cDNA全长为2467 bp,长度为1890 bp的编码框,5'-UTR长为427 bp和长为150 bp的3'-UTR。其编码629个氨基酸的蛋白质,预测该蛋白分子量大小为69.5kDa,等电点为5.10,为酸性蛋白,包含α-螺旋34.82%、延伸链9.38%、β-转角2.86%和不规则卷曲52.94%。IbbHLH2基因cDNA序列全长2280 bp,包含了编码框长度为2025 bp,5'-UTR长为108 bp,3'-UTR长147bp。IbbHLH2基因编码674个氨基酸的蛋白质,预测结果显示该蛋白分子量大小为75.1 kDa,等电点为5.07,为酸性蛋白,包含α-螺旋45.40%、延伸链10.83%、β-转角4.60%和不规则卷曲39.17%。氨基酸序列多重比对表明,虽IbbHLH1和IbbHLH2分别聚为不同支,但它们在靠近N-端的一部分和HLH结构域部分相似性较高。三级结构预测两个蛋白只有在HLH结构域部位建模成功,预测结构中IbbHLH1和IbbHLH2均由两个α-螺旋和中间连接的不规则卷曲组成,与DNA结合的活性部位位于蛋白的N-端。采用荧光定量PCR对IbbHLH1和IbbHLH2在渝紫263组织表达谱分析结果表明,IbbHLH1在须根中表达量最高,其次是叶柄、幼茎尖和茎间、块根、Φ0.5块根、茎节、叶和外周皮;而IbbHLH2在Φ0.5块根中表达量很高,在块根和外周皮中表达量也相对较高,其在其它的组织中都表达量很低。
　　 WD40类转录因子在多种植物中被鉴定为激活花色素苷转录复合体必不可少的转录因子。本研究通过RACE技术,从渝紫263中成功克隆了WD40家族中的两个WD40基因,分别命名为IbWDR1和IbWDR2,基因登录号分别为:JQ340206和JQ337864。生物信息学分析表明,IbWDR1的cDNA序列全长1239 bp,包含了长度为1032 bp的编码框,长为64bp的5'-UTR和长为143 bp的3'-UTR。IbWDR1编码343个氨基酸的蛋白质,该蛋白分子量为38.09kDa,等电点为4.97,为酸性蛋白,包含α-螺旋10.20%、延伸链34.99%、β-转角3.50%和不规则卷曲51.31%。IbWDR2的cDNA序列全长1299 bp,包含了长度为1041 bp的编码框,长为136 bp的5'-UTR和长为121 bp的3'-UTR,编码346个氨基酸的蛋白质,蛋白分子量为39.09 kDa,等电点(pI)为4.71,为酸性蛋白,包含α-螺旋10.40%、延伸链32.37%、β-转角4.91%和不规则卷曲52.31%。多重比对表明,IbWDR1和IbWDR2在各物种相对比较保守,特别是蛋白质中间偏后的一部分。三级结构预测结果显示,IbWDR1和IbWDR2均具由7个区域围成一个环状的结构,并且每个区域都是有4个β-延伸链组成。渝紫263组织表达谱分析结果表明,IbWDR1和IbWDR2在各组织中表达量均相对较高,IbWDR1在叶柄、幼茎尖、Φ0.5块根和外周皮中表达量比茎间、须根、块根、茎节和叶相对高一些;IbWDR2的表达量在Φ0.5块根、块根和幼茎尖比其它组织要高些,其它组织依次是茎节、须根、叶柄、外周皮、叶和茎间。
　　 本实验采用10 mL1%甲酸化甲醇作为提取液,提取渝紫263各组织的花色素苷,分别用HPLC和紫外分光光度计对花色素苷进行含量检测,构建渝紫263的组织含量谱。通过含量分析表明,外周皮中的花色素苷含量最高,其次是块根和基部茎,在叶和叶柄中花色素苷的含量都较低。
　　 对IbMYB1、IbbHLH1、IbbHLH2、IbWDR1和IbWDR2基因的克隆和功能分析有助于在分子水平上更好地了解这三类转录因子在花色素苷的生物合成中的作用,并为今后调控花色素苷的生物合成提供了新的靶点。结合花色素苷的含量谱分析得出IbMYB1和IbbHLH2的表达与花色素苷的合成相关性高,这为以后的代谢工程提供指导。