安全转基因油菜的获得及其抗菌核病研究

摘要

油菜是我国重要的油料作物,菌核病作为油菜生产中最主要的病害,严重影响着我国油菜的品质和产量,因此,控制油菜菌核病已成为当前油菜生产中亟待解决的问题。尽管转基凶技术已在多种作物中取得了巨大的成功,但公众对转基因作物生物安全性问题的日益担忧,明显限制了转基因技术在油菜育种中的应用。
　　 研究表明,来自益母草的抗真菌蛋白基因LJAMP2,经离体试验结果显示对菌核病菌(Sclerotinasclerotiorum)具有很强的抗性。同时,“Gene-deletor”删除系统在烟草上的成功应用,消除了转基因植物中可能存在的生物安全性问题。故在本研究中,我们将益母草脂质转移蛋白基因LJAMP2搭建在“Gene-deietor”删除系统内并转化油菜,获得安全转基因油菜。本研究的完成,可望为转基因作物生物安全性的控制提供一个应用于大田生产的技术手段。研究内容如下:
　　 1、含有抗菌肽基因LJAMP2的删除系统载体pBGP-FLP-LTP-GN的构建
　　 扩增目的基因LJAMP2连接pCXSN载体,测序正确后,双酶切含目的基因的克隆载体pCXSN-LJAMP2和载体质粒pBGP-FLP-GN,将目的片段35S-LJAMP2-Nos与载体pBGP-FLP-GN酶切大片段连接,构建成植物表达载体pBGP-FLP-LTP-GN并转化大肠杆菌DH5α,经检测验证正确后,最后转化农杆菌EHA105得到植物表达载体EHA105-pBGP-FLP-LTP-GN。
　　 2、根癌农杆菌介导的油菜菜遗传转化及分子检测
　　 以油菜品种中油821的下胚轴作为转基因受体材料,利用根癌农杆菌介导法转化来源于益母草的阳离子抗菌肽基因LJAMP2,由花粉特异性启动子基因BGP控制的删除系统载体pBGP-FLP-GN,以及含有抗菌肽基因LJAMP2的删除系统载体pBGP-FLP-LTP-GN。经高浓度卡那霉素筛选培养后获得油菜抗性植株。通过GUS组织化学染色和PCR验证共获得3个转LJAMPP2基因油菜株系,4个转pBGP-FLP-GN基因油菜株系,1个转pBGP-FLP-LTP-GN基因油菜株系,检测结果均呈阳性,初步证明外源目的基因已整合到油菜基因组中。RT-PCR证实LJAMP2和FLP基因分别在转LJAMP2和转pBGP-FLP-GN油菜植株中均能大量表达。
　　 3、转LJAMP2基因油菜抗病性检测
　　 体外抑菌试验表明,转LJAMP2基因油菜细胞粗提液对菌核病病菌的菌丝抑制力明显强于非转基因油菜细胞粗提液。进一步将菌核病病菌接种在转基因和野生型油菜叶片上离体培养,结果显示野生型植株叶片感病快且面积大,而转LJAMP2基因植株叶片仅少面积感病。显微镜下观察叶片体内病菌菌丝侵染情况,发现菌核病病菌的菌丝在非转基因油菜植株中形态正常,而在转LJAMP2基因植株叶片中,菌丝变厚变粗,且表现为卷曲形态,在叶片内扩散速度和扩散面积也小于非转基因植株叶片。上述抗性试验结果表明,在油菜中超量表达LJAMP2基因能显著提高对油菜菌核病的抗性。
　　 4、转pBGP-FLP-GN载体油菜删除效率检测
　　 比较处于发育相同阶段的野生型花粉粒,以及转LJAMP2基因油菜花粉粒的GUS组织化学染色结果,可初步证实在转pBGP-FLP-GN基因油菜的花粉粒中已实现基因删除。进一步比较转pBGP-FLP-GN基因油菜不同阶段花粉粒染色结果,显示花粉粒颜色由蓝色逐渐朝黄色变化。对所有计数花粉粒进行数据统计,结果显示转pBGP-FLP-GN载体油菜删除效率为82.51%。上述结果表明,含有pBGP-FLP-GN载体的转基因油菜植株的删除效率较高,已达到一个明显的删除效果。