小葱酸性磷酸酶的分离纯化及性质和功能基团研究

摘要

酸性磷酸酶(Acidphospoatase，简称ACP，E.C.3.1.3.2)，是一种在酸性条件下催化磷酸单酯水解释放出无机磷的巯基酶。在植物中，酸性磷酸酶直接参与磷的代谢转运过程，对植物形成良好根态结构，适应低磷胁迫具有重要作用。临床上将血清中ACP水平变化作为诊断前列腺癌、子宫颈癌、胃癌、脊髓损伤等疾病的重要指标。在环境污染监测中，以ACP水平变化来作为指标。因此近年来酸性磷酸酶引起国内外学者的广泛重视。到目前为止，已有多种来源的酸性磷酸酶得到了详细研究，但未见小葱酸性磷酸酶的研究报道。因此，本文以廉价、来源广泛的小葱为实验材料，对酸性磷酸酶进行了分离纯化以及部分酶学性质研究，旨在为酸性磷酸酶的深入应用研究提供了更多的数据支持。其结果如下:
　　 1.小葱酸性磷酸酶的分离纯化
　　 新鲜小葱通过去根，匀浆、硫酸铵沉淀、CM-Sepharose离子交换层析以及Superdex-200凝胶过滤层析等方法，获得了电泳纯的小葱酸性磷酸酶。其回收率为8.0％，纯化倍数为234.1倍，酶比活力为527.4U/mg。
　　 2.小葱酸性磷酸酶的性质研究
　　 小葱酸性磷酸酶的全酶亚基相对分子质量和相对分子质量分别为59.6kD和57.8kD，推测该酶可能由单亚基组成。它的最适反应温度为50℃，最适pH值为5.4。该酶的稳定性不是太好，其对对硝基苯磷酸二钠的表观Km值为3.63mmol/L。
　　 3.有机溶剂、化学试剂及金属离子对小葱酸性磷酸酶的影响
　　 甲醇、乙醇、异丙醇等对该酶有较强的抑制作用，10％的甘油对其具有激活作用，抗坏血酸，过氧化氢对其具有抑制作用，抗坏血酸的抑制作用比较大，而EDTA和尿素对该酶则表现出一定的激活作用。Ca2+、Ag+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Pb2+对小葱酸性磷酸酶的抑制作用比较强，Cu2+对其影响最大，最终都使酶几乎完全失活，而K+、Mg2+对酸性磷酸酶的抑制作用不是很明显，Mn2+低浓度对酶的抑制作用比较大，高浓度对其抑制作用减少。
　　 4.小葱酸性磷酸酶的功能基团研究
　　 功能基团的修饰结果表明:半胱氨酸的巯基，色氨酸的吲哚基团，二硫键和蛋白质丝氨酸残基参与了小葱酸性磷酸酶活性中心的构成，是它的必需基团。而组氨酸的咪唑基，精氨酸残基，甲硫氨酸的硫醚基，赖氨酸ε-氨基这几种基团可能不是小葱酸性磷酸酶活性中心的必需基团，只是对酶活有稍微影响。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

1．1 酸性磷酸酶的分布

1．2 酸性磷酸酶的分类

1．3 非特异性酸性磷酸酶的三维结构特点

1．4 酸性磷酸酶的作用机制

1．5 酸性磷酸酶活力的测定

1．6 酸性磷酸酶的分离纯化

1．7 酶的功能基团的研究

1．8 酸性磷酸酶活力检测的应用

1．9 小葱的简介

第二部分 引言

2．1 本研究的目的和意义

2．2 本研究的主要实验内容

2．3 技术路线

第三部分 小葱酸性磷酸酶的分离纯化及酶学性质研究

3．1 材料与试剂

3．2 实验方法

3．3 结果

第四部分 小葱酸性磷酸酶功能基团的研究

4．1 材料与方法

4．2 实验结果与分析

第五部分 讨论和展望

5．1 小葱酸性磷酸酶的分离纯化

5．2 小葱酸性磷酸酶的性质研究

5．3 小葱酸性磷酸酶功能基团的研究

5．4 展望

参考文献

致谢

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