柑橘全爪螨几丁质酶基因RNAi载体构建及其在柑橘中的转化研究

摘要

柑橘是世界第一大水果。现有巴西、中国、美国等138个国家（地区）种植柑橘，总面积1亿余亩，总产量1亿吨。我国柑橘栽培面积2700余万亩，年产量1800万吨，分列世界第一位和第二位。病虫为害是引起柑橘产量和品质下降的重要因素。在众多病虫害中，柑橘全爪螨Panonychuscitri是影响柑橘生产最为重要的影响因素。该螨主要吸食柑橘叶片、嫩梢、花蕾和果实汁液，严重时引起落叶、落花、落果，造成减产。化学防治仍是控制柑橘全爪螨最有效的措施。但由于其个体小、世代多、繁殖力强，对药剂极易产生抗性。因此，有必要选择新的防治措施。通过植物介导RNAi技术获得抗性材料是控制害虫（螨）的新途径。
　　 几丁质酶广泛存在于微生物和动植物中，对昆虫脱皮、生长发育起着重要的作用，应用RNAi技术可影响昆虫（螨类）几丁质酶基因正常表达，从而干扰昆虫（螨类）正常的生长、发育及繁殖，而通过植物介导RNAi技术可以获得抗螨材料。本试验将几丁质酶PcCht2基因特异序列作为靶标序列，构建PcCht2基因的干扰载体，进一步采用农杆菌浸染转化柑橘，旨在获得对柑橘全爪螨有抗性的新材料。
　　 1、柑橘全爪螨几丁质酶基因Unigene7021全长序列的扩增分析
　　 我们从柑橘全爪螨转录组数据库中筛选了13条几丁质酶基因，在NCBI上通过Blast检索对其序列进行比对分析，找出了一条保守性较高的基因即几丁质酶基因Unigene7021作为本研究的靶标基因。根据数据库中已知序列设计出5'-RACE和3'-RACE的扩增引物，用RACE试剂盒扩增出该基因5'-RACE和3'-RACE序列，用序列分析软件DNAMAN进行拼接分析，获得了柑橘全爪螨几丁质酶Unigene7021基因2518bp的全长序列，此序列的开放阅读框为1995bp，编码了665个氨基酸，采用DNAstar软件分析预测蛋白质的分子量约为239.94KDa，等电点为6.55。
　　 2、RNAi载体的构建
　　 本研究选取了双元载体pFGC5941作为本研究的植物表达载体，对已克隆出的几丁质酶基因Unigene7021全长序列进行分析，找出其保守区域，并根据此区域设计出带有酶切位点的RNAi反向重复序列的引物，则通过RT-PCR扩增出的正向片段上含有XhoI和AscI两个酶切位点，反向片段上含有Xbal和BamHI两个酶切位点。将植物表达载体pFGC5941质粒和含有目标序列正向干扰片段的质粒同时双酶切，用T4连接酶将正向片段连接到该载体上，获得含有正向干扰片段的载体质粒ug7021XA-pFGC5941，然后将重组载体质粒与含有反向干扰片段的TA质粒同时双酶切，酶切产物用T4连接酶连接，成功地构建了含有反向重复序列的RNAi载体ug7021XA-pFGC5941-ug7021XB。
　　 3、RNAi载体在柑橘中的转化
　　 通过电击法将重组载体质粒ug7021XA-pFGC5941-ug7021XB转化到农杆菌LBA4404感受态中，用锦橙上胚轴作为外植体，通过农杆菌侵染外植体的介导作用，将含有目标基因的重组载体质粒转化到外植体中，外植体在生长后获得一定数量的不定芽。用所设计的特异性引物对它们进行PCR检测，结果在10株不定芽中检测到了目标条带，即共获得了10株PCR阳性植株。

目录

声明

摘要

缩略符号

第一章 文献综述

1．1 柑橘产业发展现状

1．2 柑橘全爪螨的研究现状

1．2．1 柑橘全爪螨的生物学特性

1．2．2 柑橘全爪螨的遗传结构分析研究进展

1．2．3 柑橘全爪螨抗性的研究进展

1．2．4 柑橘全爪螨抗性机理的研究进展

1．3 几丁质酶的研究进展

1．3．1 几丁质酶的分布及生物学特性

1．3．2 几丁质酶在植物保护中的作用

1．4 RNAi技术原理及其应用的研究进展

1．4．1 RNAi的发现

1．4．2 RNAi的作用机制

1．4．3 RNAi的应用

1．5 柑橘遗传转化再生系统的研究进展

第二章 引言

2．1 研究的目的与意义

2．2 研究的主要内容

2．3 主要技术路线

第三章 材料与方法

3．1 材料

3．1．1 供试螨源

3．1．2 供试柑橘品种

3．1．3 实验菌株

3．1．4 分子生物学试剂

3．1．5 培养基的配制

3．1．6 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 柑橘全爪螨总RNA的提取及检测

3．2．2 RNA反转录cDNA

3．2．3 几丁质酶Unigene7021全长基因的克隆

3．2．4 PCR产物的回收、纯化、测序与比对

3．2．5 几丁质酶基因Unigene7021目标片段的扩增

3．2．6 利用RNAi技术构建干扰载体

3．2．7 工程菌的转化

3．2．8 外植体的转化

3．2．9 转化植株的初步鉴定

第四章 结果与分析

4．1 引物设计结果

4．1．1 Unigene7021基因全长cDNA克隆引物的设计

4．1．2 Unigene7021基因构建干扰载体引物的设计

4．1．3 转基因植株PCR检测引物

4．2 总RNA的提取

4．3 Unigene7021全长基因克隆的结果与分析

4．3．1 Unigene7021 5'-RACE的扩增结果

4．3．2 Unigene7021 3'-RAC的扩增结果

4．3．3 Unigene7021基因RACE测序结果分析及全长基因的获得

4．4 Unigene7021基因RNAi载体的构建

4．4．1 Unigene7021正、反向干扰片段的TA克隆与PCR扩增检测与分析

4．4．2 RNAi载体的构建

4．5 RNAi载体在柑橘中的表达结果与分析

4．5．1 农杆菌侵染外植体的结果与分析

4．5．2 PCR阳性植株的获得

第五章 讨论

5．1 关于几丁质酶Unigene7021作为目标基因的讨论

5．2 关于全长基因及干扰片段的克隆

5．2．1 全长基因的克隆

5．2．2 引物和酶切位点的设计与选择

5．3 关于构建植物RNAi表达载体的讨论

5．4 关于柑橘植株转化再生体系的讨论

5．5 关于转基因植株的抗性评价

第六章 结论

参考文献

致谢

发表论文和参研项目