利用酵母双杂交鉴定芥菜花开调控蛋白FLC的同源互作研究

摘要

芥菜（Brassica juncea Coss.）是十字花科芸薹属蔬菜作物，低温春化能诱导植株开花。FLOWERING LOCUSC(FLC)是春化途径和自主途径的关键基因，能抑制植物开花。FLC属于MIKC型MADS盒转录调节蛋白，是决定植物开花信号整合子的核心转录因子之一，处于整个开花调控网络中的枢纽地位。它的高水平表达抑制了下游开花整合基因，对开花具有强抑制作用。FLC主要在植物叶片和茎尖、根尖分生组织中广泛表达，其表达量多少与抑制开花作用强弱呈正相关。在叶片中，大量表达FLC可抑制至少两种系统信号的产生，从而推迟开花;在分生组织处，FLC通过直接抑制MADS盒转录因子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS(SOC1)及调节bZIP转录因子FD的表达，进而降低对FT蛋白信号的应答。在FRIGIDA(FRI)依赖途径中，FRI可以促进FLC的表达进而延迟开花。
　　 多个MADS盒转录因子往往能够相互作用形成蛋白复合体，从而参与植物生长发育的调控。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，FLC能够和同样是开花抑制调节蛋白的SHORT VEGETATIVEPHASE(SVP)相互作用并形成蛋白复合体，而突变体svp则在很大程度上抑制了FLC的晚花表型。芥菜SVP与FLC能够在pET原核表达系统和酵母真核表达系统中相互作用，并可以形成稳定的异源蛋白复合物。前人在拟南芥上已经证实FLC存在同源相互作用，但芥菜FLC的同源互作情况尚不清楚。
　　 为研究芥菜花期路径核心调节子FLC的同源相互作用情况，以芥菜‘QJ’为材料，克隆了FLC、FLC1-5基因片段，利用酵母双杂交体系，构建了酵母诱饵质粒pGBKT7FLC、pGBKT7FLC1～5和酵母猎物质粒pGADT7FLC，分别将猎物质粒pGADT7FLC和诱饵质粒pGBKT7FLC、pGBKT7FLC1-5转化对应的酵母菌Y2HGold、Y187，均不存在自激活和毒性现象。酵母转化子Y2HGold[pGBKT7FLC2～5]能与Y187[pGADT7FLC]融合，并可在选择性固体培养基QDO/X/A上长出蓝色菌落，证明激活了酵母的4个报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1。表明FLC能与截短体蛋白FLC2～5同源相互作用，形成蛋白复合体，而FLC的K域(FLC3)则有可能是介导FLC蛋白同源互作的关键结构域。主要研究结果总结如下:
　　 1、克隆了FLC全长基因及其截短体FLC1～5基因
　　 以芥菜‘QJ’材料的茎尖总cDNA为模板，PCR扩增出FLC全长基因，基因片段大小为625bp，测序结果表明，FLC全长基因的序列正确。以pEASY-BluntSimple-FLC质粒为模板，用特异性引物亚克隆FLC截短体FLC1～5，其片段大小分别为341bp、513bp、198bp、466bp和301bp。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增条带大小与目的基因片段相符。测序表明截短体FLC1～5的序列正确。
　　 2、构建了酵母双杂交重组表达载体
　　 构建了酵母双杂交重组诱饵质粒pGBKT7-FLC、pGBKT7-FLC1、pGBKT7-FLC2、pGBKT7-FLC3、pGBKT7-FLC4、pGBKT7-FLC5以及重组猎物质粒pGADT7-FLC。DNA测序结果分析表明，pGBKT7-FLC、pGADT7-FLC、pGBKT7-FLC1～5载体中包含有对应的目的序列(FLC全长及截短体基因)，其片段序列、插入位点和读码框均正确。
　　 3、检测了酵母双杂交重组质粒的毒性和自激活作用
　　 Y2HGold[pGBKT7-FLC]和Y2HGold[pGBKT7-FLC1～5]转化株在缺陷型SD/-Trp平板上能够长出阳性克隆，菌斑大小、密度相对于Y2HGold[pGBKT7]空载克隆均无明显差异，表明诱饵质粒pGBKT7-FLC、pGBKT7-FLC1～5对酵母均无毒性作用。Y187[pGADT7-FLC]转化株在缺陷型SD/-Leu平板上，能够长出阳性克隆，菌斑大小、密度相对于Y187[pGADT7]空载克隆均无明显差异，表明猎物质粒pGADT7-FLC对酵母均无毒性作用。
　　 另外，在SD/-Trp和SD/-Trp/x-α-gal固体培养基上，Y2HGold[pGBKT7-FLC]、Y2HGold[pGBKT7-FLC1～5]能长出阳性克隆，但在SD/-Leu/-Trp和SD/-Trp/x-α-gal/AbA固体培养基上都不能生长;在SD/-Leu和SD/-Leu/x-α-gal固体培养基上长，Y187[pGADT7-FLC]能长出阳性克隆，但在SD/-Leu/x-α-gal/AbA和SD/-Leu/-Trp固体培养基上不能生长。说明酵母载体的基因片段在酵母表达载体和对应的酵母菌株中均不能自主激活MEL1和AUR1-C报告基因，没有自身转录激活活性。由此可知，构建的酵母双杂交重组表达载体没有发生毒性和自激活现象，可用于进一步的相互作用检测分析。
　　 4、鉴定了FLC全长与全长、全长与截短体蛋白间的相互作用
　　 FLC全长蛋白能够与FLC全长蛋白融合，能在QDO/X/A固体培养基上生长，呈现不同程度的蓝色克隆，表明酵母报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1被激活;而截短体蛋白FLC2、FLC3、FLC4、FLC5同样能够与FLC全长蛋白融合，并均能在QDO/X/A固体培养基上生长，呈现不同程度的蓝色克隆，激活了酵母的4个报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1。
　　 FLC1（只含有M域和I域）不能与FLC全长蛋白相互作用，推测M域和I域在同源互作中非核心作用域;FLC2（缺少C域）能与FLC相互作用暗示这一同源复合物并不由C域决定;而FLC3（只含有K域）与FLC相互作用的结果表明K域可以介导FLC自身相互结合形成蛋白复合物;FLC4（缺少M域）能与FLC全长蛋白互作暗示该蛋白相互作用也不由M域决定;FLC5（缺少M域和I域）能与FLC相互作用暗示I域同样不决定此相互作用。因此，无论M域、I域还是C域，均无法介导FLC蛋白自身的相互作用，K域则极可能介导FLC蛋白同源相互作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 芸薹属蔬菜花期分子调控的研究进展

1．1．1 光周期途径

1．1．2 春化途径

1．1．3 自主途径

1．1．4 赤霉素途径

1．1．5 其他途径

1．2 花期调控蛋白FLC的研究进展

1．2．1 FLC花期调控机理的研究进展

1．2．2 FLC同源蛋白的研究进展

1．3 蛋白质相互作用的研究进展

1．3．1 蛋白质相互作用概述

1．3．2 研究蛋白质相互作用常用方法

1．3．3 展望

1．4 酵母双杂交系统

1．4．1 酵母双杂交系统的原理

1．4．2 酵母双杂交系统的特点

1．4．3 酵母双杂交系统在蛋白互作研究中的应用

1．4．4 酵母双杂交系统的展望

第二章 引言

第三章 材料与方法

3．1 材料

3．1．1 材料

3．1．2 菌株与载体

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 主要生化试剂和分子生物学试剂盒

3．2 方法

3．2．1 芥菜茎尖总RNA提取

3．2．2 cDNA第一链合成

3．2．3 FLC与其截短体基因扩增区的引物设计

3．2．4 FLC全长基因的克隆

3．2．5 FLC截短体基因的亚克隆

3．2．6 序列信息的分析

3．2．7 FLC及其截短体的酵母重组表达载体构建

3．2．8 酵母双杂交系统鉴定FLC与其截短体间的同源相互作用

第四章 结果与分析

4．1 芥菜总RNA的提取

4．2 芥菜FLC基因及其截短体的克隆与分析

4．2．1 芥菜FLC基因及其截短体的克隆

4．2．2 FLC与其截短体蛋白的序列分析

4．3 酵母重组表达载体的鉴定和序列分析

4．3．1 重组诱饵质粒pGBKT7-FLC、pGBKT7-FLC1~5的鉴定及序列分析

4．3．2 重组猎物质粒pGADT7-FLC的鉴定及序列分析

4．4 酵母重组质粒的毒性检测

4．4．1 重组诱饵质粒的毒性检测

4．4．2 重组猎物质粒的毒性检测

4．5 酵母重组质粒的自激活检测

4．6 FLC与其截短体蛋白间的相互作用鉴定

4．6．1 FLC全长与全长蛋白间的相互作用

4．6．2 FLC全长与其截短体蛋白间的相互作用

第五章 讨论

第六章 结论

6．1 成功克隆了FLC全长基因及其截短体FLC1~5基因片段

6．2 成功构建了酵母双杂交重组表达载体

6．3 酵母双杂交重组表达载体无毒性和自激活作用发生

6．4 FLC全长与全长、全长与片段间相互作用鉴定

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文

在读期间参与的科研项日