桔小实蝇γ-氨基丁酸相关酶的生化及分子毒理学特性研究

摘要

桔小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)隶属于双翅目Diptera，实蝇科Tephritidae，是一种危险的农业害虫。因其世代历期短、繁殖力强、加之杀虫剂的不合理使用，桔小实蝇已对多种杀虫剂产生了抗性。目前，有关桔小实蝇的抗性监测、机理和治理的研究日益增多，研究焦点集中于桔小实蝇解毒酶(P450s、GSTs和CarEs等)的生化毒理学及靶标(如AChR)的分子生物学特性等方面，而对其他昆虫中研究非常多的γ-氨基丁酸受体(GABA)及相关酶的生化及分子毒理学特性还鲜有报道。
　　 本研究以桔小实蝇为研究对象，探讨GABA受体及相关酶在抗药剂胁迫中的作用。采用局部点滴法测定了桔小实蝇福州种群对阿维菌素的敏感性;在此基础上，采用酶标板滴定法测定了阿维菌素处理前后，桔小实蝇体内谷氨酸脱羧酶(GAD)和γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)的比活力变化;此外，基于转录组数据及RACE技术，开展了GABA受体相关基因的全长序列克隆，并对所得基因响应阿维菌素刺激的表达模式进行了解析。论文从生理生化和分子生物学角度分析了桔小实蝇GABA相关酶和基因的毒理学特性。获得的主要结果如下:
　　 1、桔小实蝇对阿维菌素的敏感性测定
　　 采用局部点滴法测定了桔小实蝇福州种群对阿维菌素的敏感性，并与东莞、广州、海口和昆明等4个地理种群的生测结果进行了比较分析。24h生测结果表明，桔小实蝇昆明种群对阿维菌素最敏感，福州种群次之，东莞种群最不敏感。与桔小实蝇东莞、广州和海口种群相比，昆明和福州2个种群对阿维菌素敏感性差异均达到显著水平。根据阿维菌素的作用特点，测定了72h的敏感性，LD50仅0.475ng/fly。
　　 2、桔小实蝇GABA相关酶的生化毒理学特性研究
　　 2.1、GABA含量测定
　　 采用HPLC法测定了阿维菌素处理前后桔小实蝇的GABA含量。结果表明，经阿维菌素LD10的剂量处理24h后，桔小实蝇GABA含量升高，但差异不显著（1.13倍，P＞0.05）;而经LD50的剂量处理24h后，GABA含量显著升高(1.34倍，P＜0.05)。初步推测桔小实蝇通过保持高含量的GABA来应对阿维菌素的胁迫。
　　 2.2、GABA-T和GAD比活力测定
　　 采用微量滴度酶标板法测定了桔小实蝇与GABA含量相关的GABA-T和GAD比活力。结果显示，经过阿维菌素不同剂量(LD10和LD50)处理后，GABA-T比活力无显著性变化，而GAD的比活力与阿维菌素的处理剂量和处理时间成正相关。表明GABA含量升高是GAD比活力增强的结果。
　　 3、桔小实蝇GABA相关酶的分子生物学特性研究
　　 3.1、GABA受体相关基因的克隆
　　 基于转录组测序，结合RT-PCR和RACE技术，从桔小实蝇体内克隆获得GABA受体相关的2个基因cDNA全长和3个基因的片段序列。上述基因提交至GenBank后的名称和登录号分别为BdGAP(JQ796071.1)、BdGD1(KC763804)和BdGAF(KC763801)、BdGBR(KC763802)、BdSCD(KC763803)。应用Protparam、Scanprosite等生物信息学软件分析了预测蛋白质的理化性质。此外，采用软件MEGA5.0最大似然法(Maximum-likelihoodmethod，ML)构建了桔小实蝇上述5个GABA受体相关基因的系统发育树，结果显示它们和其它双翅目昆虫的亲缘关系非常近。
　　 3.2、GABA受体相关基因的表达模式解析
　　 以桔小实蝇α-Tubulin作为内参基因，采用qPCR技术测定了BdGAF、BdGBR、BdSCD和BdGD1在不同发育阶段（卵、幼虫、蛹和成虫）、不同体段（头、胸和腹）以及阿维菌素处理前后的mRNA表达模式。检测结果表明，桔小实蝇GAF基因在卵期表达量最高，GBR、GD1基因在幼虫期表达量最高，而SCD基因在成虫的表达量最高;不同体段的测定结果表明，GBR、SCD在头部表达量显著高于胸部和腹部，GAF基因在各体段表达量基本一致，而GD1基因在腹部表达量最高;阿维菌素处理前后的表达量测定结果显示，以LD50的剂量处理不同时间后，SCD基因的表达量变化在1-2倍之间;GAF、GBR和GD1基因在处理后表达量显著上升，且随着处理时间延长而升高;经不同剂量的阿维菌素处理24h后，桔小实蝇GAF、GBR和SCD基因表达量较对照均有显著上升，且随着剂量增加而升高，而GD1的表达量在亚致死剂量LD10处理后上升，在致死中量LD50处理后较对照却下降。
　　 研究从生理生化和分子生物学角度对桔小实蝇应对阿维菌素胁迫的机制进行分析。研究结果将丰富桔小实蝇药剂代谢和抗性形成的生化和分子机理，为实际生产中制定延缓抗性发展的策略，探索抗性治理策略提供必要的理论依据。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1 桔小实蝇

1．1 桔小实蝇的分类地位

1．2 分布及危害

1．3 抗药性及治理

2 阿维菌素及其抗药性

3 γ-氨基丁酸及其相关酶

3．1 γ-氨基丁酸的合成与代谢

3．2 γ-氨基丁酸含量测定

3．3 谷氨酸脱羧酶

3．4 γ-氨基丁酸转氨酶

4 γ-氨基丁酸受体

4．1 γ-氨基丁酸受体的结构与功能

4．2 γ-氨基丁酸受体与昆虫的抗药性

引言

第二章 桔小实蝇对阿维菌素的敏感性测定

1 材料与方法

1．1 供试虫源

1．2 供试药剂

1．3 实验器材

1．4 生物测定

2 结果与分析

3 讨论

第三章 桔小实蝇γ-氨基丁酸相关酶生化及毒理学特性研究

第一节 桔小实蝇γ-氨基丁酸含量的测定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 桔小实蝇γ-氨基丁酸转氨酶比活力测定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三节 桔小实蝇谷氨酸脱羧酶比活力测定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 桔小实蝇GABA相关基因的cDNA克隆及表达模式

第一节 基于转录组数据的桔小实蝇GABA受体相关基因cDNA克隆及序列分析

1．实验材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

第二节 桔小实蝇GABA相关基因的表达模式解析

1 实验材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

第五章 主要结果、结论与研究展望

1 主要结果和结论

2 研究展望

参考文献

在读期间发表的论文

致谢