LeGGPS2、AtCAO与AtHEMA1基因对烟草耐弱光性的影响

摘要

弱光是目前制约设施生产的重要因素。研究表明弱光逆境不仅会引起植物叶绿素含量的变化，而且影响光合速率、光合产物的运输与分配，进而影响植物的生长发育。转基因技术具有其独特的优势，是国际上公认的改良作物农艺性状的可行技术，且在提高作物光合速率方面已取得一定进展，但弱光性状是多基因控制的数量性状，利用转化色素合成关键基因提高作物光合速率及耐弱光性的报道迄今少见。
　　 本研究通过分析叶绿素和类胡萝卜素的合成途径，从拟南芥中克隆叶绿素合成初期的关键基因谷氨酰-tRNA还原酶基因（AtHEMA1）、催化叶绿素b合成的关键基因叶绿素酸酯a氧化酶基因(AtCAO);并构建了含番茄牻牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶基因（LeGGPS2）的双元表达载体pVCT2295，含AtCAO、AtHEMA1基因的双元表达载体pVCT2299;通过农杆菌介导法将LeGGPS2基因、AtCAO与AtHEMA1基因转入烟草。对转基因烟草植株进行弱光处理后，分析导入基因对烟草光合色素含量、光合速率、光合产物及植株生长发育的影响。
　　 主要结果如下:
　　 1.构建了含LeGGPS2基因的双元表达载体pVCT2295，并成功转化烟草
　　 将从番茄品种Ailsa Craig（Solanum lycopersicon L.cv.Ailsa Craig）中克隆的LeGGPS2基因插入到载体pVCT2024中，构建了含有LeGGPS2等基因的双元载体pVCT2295，经农杆菌介导转化烟草。对Kan抗性烟草植株进行PCR鉴定、荧光检测，证明获得了整合有Pnos-nptII、35S-LeGGPS2和35S-GFP外源基因的转基因烟草植株9株。
　　 2.LeGGPS2基因增强了弱光下烟草的光合性能，且增加了生物量积累
　　 弱光处理后，转基因烟草株系TG1、TG2的类胡萝卜素含量、叶绿素含量、光合速率均比野生烟草增加，达到了差异显著性水平，可见转入LeGGPS2基因可提高烟草弱光下的光合性能。另外，转基因烟草的叶面积增长量、单位叶面积重量、总干重、根冠干重比，均比野生烟草高，证明转入该基因可提高烟草的生物量积累并促进其向根部的分配。
　　 3.克隆了AtCAO与AtHEMA1基因
　　 参照GenBank中公布的拟南芥叶绿素酸酯a加氧酶(AtCAO)、谷氨酰tRNA还原酶（AtHEMA1）基因序列，设计特异PCR引物，采用PrimStar HS DNA聚合酶从拟南芥(Arabidopsis thaliana L.Ecotype Columbia) gDNA中扩增目的片段，分别TA克隆进T-载体pMD18-T和pMD19-T，构成载体pVCT1263、pVCT1298。测序结果显示与网上公布序列一致，表明成功克隆了AtCAO与AtHEMA1基因。
　　 4.成功获得了分别含AtCAO基因、AtHEMA1基因的植物表达载体pVCT2296和pVCT2298
　　 将克隆的AtCAO基因插入到载体pVCT2100中，构建含有npt(II)、AtCAO基因的表达载体pVCT2296;将克隆的AtHEMA1基因插入到载体pVCT2101中，构建含有npt(II)、AtHEMA1基因的表达载体pVCT2298;通过PCR和酶切鉴定，证明载体pVCT2296、pVCT2298构建成功。
　　 5.获得了含AtCAO与AtHEMA1基因的植物表达载体pVCT2299并成功转化烟草
　　 将克隆的AtCAO基因插入到载体pVCT2298中，构建了含有npt(II)、AtCAO、AtHEMA1基因的表达载体pVCT2299，并经过农杆菌介导转化烟草，对Kan抗性烟草植株进行PCR鉴定，证明获得了整合有npt(II)、AtCAO、AtHEMA1外源基因的转基因烟草植株24株。进一步对选取的转基因烟草株系TL1、TL2进行Southern杂交，证实获得了含单拷贝基因的烟草植株。
　　 6.转AtCAO和AtHEMA1双价基因不仅促进烟草叶绿素b合成，且促进生长发育，显示出能增强烟草的耐弱光性
　　 弱光下转基因烟草相比野生烟草，叶绿素总量增加不显著，但叶绿素b含量增加16％～17％，叶绿素a/b比值降低9％～12％，光合作用增强42％～65％，均达到差异显著水平，而且生长发育比野生烟草快。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 植物弱光耐受性的研究概况

1．1．1 弱光逆境的定义

1．1．2 弱光逆境对植物生长发育的影响

1．1．3 弱光逆境对植物光合特性的影响

1．1．4 弱光逆境对植物光合色素含量及叶绿素荧光特性的影响

1．1．5 弱光逆境对植物酶系统的影响

1．1．6 弱光逆境对植物信号转导及内源激素的影响

1．2 利用转基因技术提高植物耐弱光性的可行性

1．2．1 常规育种难以满足生产发展需求

1．2．2 碳同化方面，转入相关光合酶基因

1．2．3 色素合成方面，转入叶绿合成基因

1．2．4 光氧化方面，转入抗氧化酶基因

1．3 GGPS基因与光合作用的关系

1．3．1 GGPS基因在类胡萝卜素合成途径中的作用

1．3．2 类胡萝卜素与光合作用的关系

1．4 AtHEMA1、AtCAO基因与光合作用的关系

1．4．1 AtHEMA1、AtCAO基因在叶绿素合成途径中的作用

1．4．2 叶绿素与光合作用的关系

2 引言

2．1 研究的目的与意义

2．2 研究的主要内容

2．2．1 LeGGPS2基因对烟草耐弱光性的影响

2．2．2 AtCAO、AtHEMA1基因对烟草耐弱光性的影响

2．3 技术路线

3 LeGGPS2基因对烟草耐弱光性的影响

3．1 材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌株、质粒和PCR引物

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 主要生物学试剂

3．1．5 各种试剂及培养基的配制

3．2 实验方法

3．2．1 含LeGGPS2基因的植物双元表达载体pVCT2295的构建

3．2．2 农杆菌介导载体pVCT2295转化烟草

3．2．3 转基因烟草的分子鉴定

3．2．4 LeGGPS2基因对烟草耐弱光性的影响

3．2．5 转基因烟草T1代植株的鉴定

3．3 结果与分析

3．3．1 构建了含LeGGPS2基因的植物表达载体pVCT2295

3．3．2 得到卡那霉素抗性烟草植株

3．3．3 转基因烟草植株的PCR检测

3．3．4 转基因烟草植株的荧光检测

3．3．5 转LeGGPS2基因对弱光下烟草光合性能的影响

3．3．6 转LeGGPS2基因对弱光下烟草生长和生物量积累的影响

3．3．7 转基因烟草T1代植株的鉴定

3．4 讨论

3．4．1 含LeGGPS2基因的植物表达载体的构建

3．4．2 LeGGPS2基因的遗传转化

3．4．3 LeGGPS2基因转烟草的鉴定

3．4．4 转LeGGPS2基因对烟草耐弱光性的影响

3．4．5 后续研究

4 AtCAO、AtHEMA1基因对烟草耐弱光性的影响

4．1 材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 菌株、质粒和PCR引物

4．1．3 主要仪器设备

4．1．4 主要试剂和试剂盒

4．1．5 各种试剂及培养基的配制

4．2 实验方法

4．2．1 含AtCAO基因的植物表达载体pVCT2296的构建

4．2．2 含AtHEMA1基因的植物表达载体pVCT2298的构建

4．2．3 含AtCAO、AtHEMA1基因的植物表达载体pVCT2299的构建

4．2．4 农杆菌介导载体pVCT2299转化烟草

4．2．5 转AtCAO与AtHEMA1基因烟草的分子鉴定

4．2．6 转AtCAO与AtHEMA1基因对烟草耐弱光性的影响

4．2．7 转基因烟草的T1代植株的鉴定

4．3 结果与分析

4．3．1 构建了含AtCAO基因的植物表达载体pVCT2296

4．3．2 构建了含AtHEMA1基因的植物表达载体pVCT2298

4．3．3 构建了含AtCAO和AtHEMA1基因的植物表达载体pVCT2299

4．3．4 获得卡那抗性烟草植株

4．3．5 转基因烟草植株的分子鉴定

4．3．6 转AtCAO和AtHEMA1基因对烟草耐弱光性的影响

4．3．7 转基因烟草T1代植株的鉴定

4．4 讨论

4．4．1 AtCAO、AtHEMA1基因的克隆

4．4．2 含AtCAO、AtHEMA1基因表达载体的构建

4．4．3 转AtCAO、AtHEMA1基因对烟草光合性能的影响

4．4．4 转AtCAO与AtHEMA1基因对烟草生长发育的影响

4．4．5 烟草的栽培

4．4．6 研究展望

5 结论与创新点

5．1 结论

5．2 创新点

参考文献

附录

致谢

发表论文及参加课题一览表