小檗碱提取物抑制多重耐药大肠埃希菌外排喹诺酮类药物的研究

摘要

近年来，由于病原菌特别是大肠杆菌对喹诺酮类药物(Qs)耐药性日益严重，使得Qs临床治疗效果严重降低，造成治疗成本升高、养殖风险增大、药物使用剂量加大、导致药物残留等食品安全问题。因此，如何提高Qs的治疗效果，不仅事关养殖业的健康发展，更是关乎食品安全乃至人类健康的社会问题。从Qs耐药性的产生特点及能否逆转的角度，耐药性控制和逆转的研究主要集中在新药开发与筛选理想的外排抑制剂上。新药研发需要耗费大量的人力、物力、财力与时间，且开发出的新药又可能很快产生耐药性，因此很难及时解决当前日益严重的耐药性问题。外排抑制剂是能够消除细菌等多重耐药性的一类物质，通过有效抑制主体的药物转运蛋白（外排泵）活性，包括细菌、癌细胞等，减少药物排出量。中药有效成分相对安全、残留小、无耐药性危害等，在产品研发与临床应用上具有明显优势，所以具有外排抑制活性的天然药物不仅能够提高由外排泵介导耐药病原菌对药物的敏感性，还有利于减少由外排作用促进的耐药突变株的产生，具有较大的临床应用价值，对于耐药菌感染的治疗以及畜牧业的健康发展有着深远的意义。本试验通过前期筛选的中药十大功劳为研究对象，提取其主要有效成分小檗碱，研究其是否具有抑制多重耐药大肠埃希菌外排喹诺酮类药物的作用，为后期外排泵抑制剂的确认奠定基础，同时也为新外排抑制剂的研制提供理论依据。
　　 1、小檗碱提取物的制备
　　 采用乙醇回流提取法提取十大功劳中的有效成分小檗碱，并参照药典方法对小檗碱提取物进行鉴别，采用高效液相色谱法(HPLC)对其进行含量测定。
　　 结果:乙醇回流提取法提取十大功劳中小檗碱的提取率为1.2％;经鉴别均符合2010版中国药典中盐酸小檗碱项下的鉴别试验;小檗碱对照品溶液回归方程为:A=170931C+167702，线性范围15～135μg/mL(r=0.9996)，测得所制备的小檗碱提取物含量为97.3％。
　　 结论:采用乙醇回流提取法提取小檗碱，经精制后小檗碱的纯度达到97.3％，该方法具有可行性;本试验所建立的高效液相色谱检测法结果准确可靠，可作为小檗碱提取物的含量测定方法。
　　 2、小檗碱提取物体外抑菌试验
　　 采用美国临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的肉汤稀释法，分别测定乳酸环丙沙星(Cip)及小檗碱提取物对质控菌ATCC25922及耐药菌73-2的最小抑菌浓度(MIC)，并将小檗碱提取物与乳酸环丙沙星联合，检测其对乳酸环丙沙星抑菌效果的影响，以能量抑制剂碳酰氰间氯苯腙(CCCP)作为药物对照。
　　 结果:乳酸环丙沙星对质控菌ATCC25922及耐药菌73-2的MIC值分别为0.0078μg/mL和256μg/mL，小檗碱提取物对质控菌ATCC25922及耐药菌73-2的MIC值分别为＞500mg/mL和＞500mg/mL。小檗碱提取物与乳酸环丙沙星联合应用，表现为乳酸环丙沙星对质控菌ATCC25922的MIC值没有变化，对耐药菌73-2的MIC值变为4μg/mL，降为原来的1/64;CCCP与乳酸环丙沙星联合应用，表现为乳酸环丙沙星对质控菌ATCC25922的MIC值没有变化，对耐药菌73-2的MIC值变为8μg/mL，降为原来的1/32。
　　 结论:小檗碱提取物联合乳酸环丙沙星能够提高耐药大肠埃希菌对乳酸环丙沙星的敏感性，表现出良好的耐药抑制作用，且效果优于CCCP。
　　 3、小檗碱提取物对受试菌株乳酸环丙沙星蓄积量的影响
　　 采用高效液相色谱法分别检测质控菌ATCC25922与耐药菌73-2加与未加小檗碱提取物，细菌体内乳酸环丙沙星(Cip)的蓄积量，并以CCCP作为药物对照。
　　 结果:加入小檗碱提取物后，质控菌体内乳酸环丙沙星蓄积量几乎无变化，耐药菌73-2菌体内乳酸环丙沙星蓄积量明显增加，约为未加小檗碱提取物组的2.62倍;加入CCCP后，质控菌体内乳酸环丙沙星蓄积量几乎无变化，耐药菌73-2菌体内乳酸环丙沙星蓄积量明显增加，约为未加CCCP组的2.25倍。
　　 结论:小檗碱提取物与CCCP均可以增加耐药菌73-2菌体内乳酸环丙沙星的蓄积量，表现出良好的外排抑制作用，且前者效果优于后者。
　　 4、小檗碱提取物对菌株73-2 acrA基因表达量的影响
　　 通过小檗碱提取物处理耐药大肠杆菌73-2，利用实时荧光定量PCR技术检测其外排泵基因acrA表达量的变化。
　　 结果:经小檗碱提取物处理的耐药大肠埃希菌模型73-2 acrA表达量降低，其外排泵基因表达量变为原来的0.19倍。
　　 结论:小檗碱提取物对耐药大肠埃希菌的外排泵基因表达量有明显的抑制作用。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 细菌外排泵系统的组成、种类

1．2 几种常见耐药病原菌中的主要外排机制

1．3 外排泵抑制剂

第2章 引言

2．1 研究目的与意义

2．2 研究范围与内容

第3章 小檗碱提取物的制备

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 分析与讨论

第4章 小檗碱提取物体外抑菌试验

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 分析与讨论

第5章 小檗碱提取物对受试菌体乳酸环丙沙星蓄积量的影响

5．1 材料与方法

5．2 结果

5．3 分析与讨论

第6章 小檗碱提取物对菌株73-2 acrA基因表达量的影响

6．1 材料与方法

6．2 结果

6．3 分析与讨论

第7章 结论

参考文献

致谢

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