Ca2+、P对酸铝胁迫后紫花苜蓿—根瘤菌共生体系的修复研究

摘要

酸性土壤在全世界分布广泛，而且有不断恶化的趋势。酸性土壤中铝离子从硅酸盐矿物中游离出来会对植物和微生物造成毒害。对豆科植物而言，酸铝毒害不仅影响宿主根尖生长、根瘤菌存活，还会影响二者共生结瘤过程。酸铝毒害速度极快，一般在几个小时内就能够引起植物根尖细胞受损和微生物个体死亡。所以，研究豆科植物-根瘤菌遭受酸铝毒害后的修复/恢复对维持根瘤菌在酸铝胁迫下生物固氮的可持续性具有一定意义。已有研究多通过向酸铝土壤施加Ca2+、P可以缓解酸铝毒害，本研究则选择紫花苜蓿及其耐酸根瘤菌91522为研究对象，研究在酸铝毒害后施Ca2+、P对紫花苜蓿-根瘤菌体系共生、结瘤、固氮以及群体感应等的恢复/修复效应，初步评估少量补充Ca2+、P对酸铝胁迫后苜蓿根瘤菌共生体系恢复/修复效果的实践意义。通过研究，取得了以下结果:
　　 (1)纯培养条件下，酸铝胁迫将使根瘤菌的生长受到极大限制，对数期滞后，稳定期到达延迟。补充不同浓度的Ca2+可以显著提高根瘤菌的生长速率，对数期、稳定期提前，同时补充适当的P素可进一步提高耐酸根瘤菌的生长速率。一定的Ca2+浓度处理下，补充4μmol·L-1P处理对数期比对照的提前了4-6h;根瘤菌在pH5.0和Al3+浓度30μmol·L-1的液体YMA培养基上生长12h后死亡率达到75.9％，通过补充少量P素(4μmol·L-1)存活率比对照提高3.8％，补充5和10mmol·L-1Ca2+存活率显著提高，分别达到35.3％和37.1％，而且高浓度Ca2+与低浓度差异不显著，所以5mmol·U-1Ca2+即可达到显著修复效果。钙磷交互效应显著，在10mmol·L-1Ca2+处理下补充4μmol·L-1P根瘤菌存活率进一步提高至38.6％;酸铝胁迫下，培养基中根瘤菌群体感应水平＜70MillerUnits，通过补充Ca2+5mmol·L-1和P30μmol·L-1处理能够使培养基中群体感应水平升高最多，达到120MillerUnits，该条件下S.meliloti91522自体诱导物的分泌显著恢复和增加，修复和促进苜蓿和根瘤菌间的信息交流，为良好的结瘤提供保障。
　　 (2)酸铝胁迫处理苜蓿幼苗12h后进行钙磷修复处理，对照处理中苜蓿初生根1d的伸长量不足3.3mm，不同浓度的P促进了根尖伸长，但不显著;补充5和10mmol·L-1Ca2+根尖伸长量显著提高，分别达到19.7mm、14.3mm，有效缓解酸铝毒害对根尖生长的抑制，但高浓度Ca2+并不利于苜蓿初生根的生长，Ca2+5mmol·L-1和P30μmol·L-1处理根尖恢复效果最好。
　　 (3)在受酸铝毒害后，Ca2+对紫花苜蓿-根瘤菌结瘤过程有显著的修复效应，补充5、10mmol·L-1Ca2+条件下，根瘤菌群体感应、根瘤固氮酶活性有显著的提高;4μmol·L-1P素营养与Ca2+的上述促进作用有交互效应，而且该交互效应导致苜蓿现瘤时间较未经修复处理的提前14天，结瘤总数提高了247.09％，结瘤率可达到90％，使根毛变形率由无Ca2+、P处理的3.33％提高到28.89％。Ca2+、P对结瘤动力学曲线影响主要体现在Ca2+对同期结瘤数有显著修复效果，并且这种修复从开始结瘤起就非常明显，P素对结瘤数影响在Ca2+5mmol·L-1条件下较显著;Ca2+对固氮酶活性有显著提高作用，但高浓度Ca2+(10mmol·L-1)效果不如低浓度(5mmol·L-1)，同时4μmol·L-1P浓度可以进一步提高固氮酶活性。本研究进一步验证群体感应强度在苜蓿根瘤菌共生过程中的重要意义，而且补充Ca2+、P能够显著提高酸铝胁迫下根瘤菌自体诱导物(AHLs)含量，即提高了根瘤菌的群体感应水平，可能是Ca2+、P对紫花苜蓿-根瘤菌结瘤过程有显著的修复效应的内在机理之一。
　　 (4)分室培养箱试验中，间接接种根瘤菌原位检测根瘤菌在酸铝胁迫土壤中的迁移定殖动态，施加5、10mmol·L-1Ca2+条件下，根瘤菌的迁移快于0mmol·L-1Ca2+处理，补充30μmol·L-1P对根瘤菌的迁移、繁殖有促进作用。Ca2+、P存在交互作用，此试验条件下，酸性土壤中补充1mmol·kg-1Al3+，增强了逆境胁迫条件，补充5mmol·L-1钙和30μmol·L-1P可显著提高苜蓿的存活、迁移能力及繁殖速度。从群体感应这一化学行为角度出发，施加Ca2+、P后酸铝胁迫下土壤中根瘤菌群体感应强度得到显著提高。整个培养时期，5mmol·L-1Ca2+和30μmol·L-1P处理下根瘤菌群体感应一直处于较高水平，为良好的结瘤提供了保障。施加少量Ca2+、P能够使土壤中速效P和交换性Ca2+有显著提高，土壤交换性盐基离子提高，一定程度上抑制了土壤潜在酸的释放。相关性分析表明，土壤交换性Ca2+与非根际土壤中根瘤菌数量显著正相关，相关系数分别为0.316(p=0.001)和0.363(p=0.004)，与土壤中交换性铝有不显著的负相关关系。整个培养时期，非根际土壤和根际土壤中的根瘤菌数量显著相关，相关系数为0.765(p=0.001)，非根际土壤和根际土壤中的根瘤菌群体感应强度相关性极显著，相关系数为0.919(p=0.000)，整个培养过程中群体感应强度与根瘤菌数量呈显著正相关关系，相关系数为0.335(p=0.007)。
　　 (5)通过在酸铝毒害后的土壤中补充少量Ca2+、P(5mmol·L-1Ca2+、30μmol·L-1P)，能够显著地恢复毒害效应，使紫花苜蓿结瘤数提高，生物量、株高、根长得到有效的提高。在酸铝胁迫后，补充Ca2+、P能够提高土壤中根瘤菌的数量，进而提高结瘤数量。与对照相比，施加适当浓度的Ca2+、P能够有效提高土壤中微生物量，即微生物活性。同时根瘤菌群体感应强度的提高可能是结瘤固氮性能的重要保证，相关性分析表明，根瘤菌数量和群体感应强度与苜蓿生物量显著相关，相关系数分别为0.916(p=0.000)和0.847(p=0.000)，而且根瘤菌数量与群体感应强度显著相关，所以施加Ca2+、P提高了苜蓿根瘤菌的耐酸铝能力，成为恢复效应的重要原因。酸性土壤中施加过多的钙不仅会抑制豆科植物的生长、结瘤固氮，而且会造成肥料浪费。研究中除结瘤数外，5mmol·L-1Ca2+的处理对其他指标的恢复效果均较10mmol·L-1Ca2+好，高钙条件下虽然有利于结瘤数的提高，但可能存在大量的无效根瘤。施加钙能够短期内提高土壤的盐基离子总量和盐基饱和度，这可能对苜蓿根瘤菌共生固氮有正面影响，需进一步量化研究。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 文献综述

1．1 我国土壤酸化性状及铝毒害

1．1．1 土壤酸化现状及危害

1．1．2 酸铝毒害对植物的影响研究进展

1．1．3 酸铝毒害对微生物的影响研究进展

1．2 豆科植物-根瘤菌耐酸铝研究进展

1．2．1 酸铝毒害对豆科植物-根瘤菌的影响

1．2．2 耐酸豆科植物品种的选育

1．2．3 筛选和接种耐酸根瘤菌提高豆科植物耐酸铝能力

1．2．4 施加钙、磷缓解酸铝毒害的研究进展

1．3 根瘤菌群体感应的研究进展

1．3．1 根瘤菌群体感应简述

1．3．2 根瘤菌群体感应与结瘤固氮

第2章 绪论

2．1 研究背景与意义

2．2 研究目标

2．3 研究内容

2．4 研究的可行性

2．5 拟解决的关键问题

2．6 技术路线

第3章 钙磷对酸铝胁迫后耐酸根瘤菌及苜蓿根尖的恢复研究

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．1．3 数据处理

3．2 结果与分析

3．2．1 钙磷交互作用对酸铝胁迫下苜蓿根瘤菌生长影响

3．2．2 钙磷交互作用对酸铝胁迫下苜蓿根瘤菌存活率影响

3．2．3 钙磷交互作用对苜蓿初生根酸铝胁迫下的伸长量影响

3．2．4 钙磷交互作用对酸铝胁迫下苜蓿根瘤菌稳定期群体感应强度的影响

3．2．5 生长前期根瘤菌存活率与稳定期群体感应强度的相关关系

3．3 讨论

3．4 小结

第4章 钙磷对酸铝胁迫后紫花苜蓿-根瘤菌体系结瘤固氮的修复效应

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．1．3 测定方法

4．1．4 数据处理

4．2 结果与分析

4．2．1 钙磷交互作用对酸铝胁迫后苜蓿结瘤的影响

4．2．2 钙磷交互作用对酸铝胁迫后苜蓿根毛变形的影响

4．2．3 群体感应QS

4．2．4 固氮酶活性

4．2．5 钙磷交互作用对紫花苜蓿受酸铝胁迫后农艺性状的影响

4．2．6 钙磷交互作用对紫花苜蓿受酸铝胁迫后根系活力的影响

4．2．7 相关性分析

4．3 讨论

4．4 小结

第5章 钙磷对酸铝土壤中苜蓿根瘤菌迁移繁殖和群体感应的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 试验设计

5．1．3 测定项目与方法

5．1．4 数据处理

5．2 结果与分析

5．2．1 钙磷交互作用对酸铝土壤中苜蓿根瘤菌迁移定殖的影响

5．2．2 钙磷交互作用对酸铝土壤中苜蓿根瘤菌群体感应强度的影响

5．2．3 钙磷交互作用对酸铝土壤中苜蓿-根瘤菌结瘤和生物量的影响

5．2．4 钙磷交互作用对酸铝土壤交换性能的影响

5．2．5 相关性分析

5．3 讨论

5．4 小结

第6章 酸铝土壤中钙磷对酸铝胁迫后耐酸根瘤菌及苜蓿共生体系的恢复研究

6．1 材料与方法

6．1．1 试验材料

6．1．2 试验设计

6．1．3 测定项目及方法

6．1．4 数据处理

6．2 结果与分析

6．2．1 钙磷处理对酸铝胁迫后紫花苜蓿根瘤菌共生体系生物量和结瘤的影响

6．2．2 钙磷处理对酸铝胁迫后紫花苜蓿根瘤菌群体感应强度的影响

6．2．3 钙磷处理对酸铝胁迫后紫花苜蓿根瘤菌共生土壤中微生物量的影响

6．2．4 钙磷处理对酸铝胁迫后紫花苜蓿根瘤菌共生土壤中根瘤菌数量的影响

6．2．5 不同处理过程中紫花苜蓿根瘤菌共生土壤速效磷与交换性钙的变化

6．2．6 初始土壤交换性钙与速效磷和试验中各指标的相关关系

6．3 讨论

6．4 小结

第7章 结论与展望

7．1 结论

7．1．1 水培条件下，钙、磷对紫花苜蓿、耐酸根瘤菌酸铝胁迫后的修复效应初探

7．1．2 水培条件下，钙、磷对紫花苜蓿-根瘤菌体系酸铝胁迫后的结瘤固氮和群体感应的修复

7．1．3 酸铝土壤条件下，钙、磷对耐酸苜蓿根瘤菌的迁移定殖和群体感应的影响

7．1．4 酸铝土壤条件下，钙、磷对紫花苜蓿-根瘤菌共生体系的修复效果和应用评估

7．2 展望

参考文献

致谢

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