β淀粉样肽刺激小胶质细胞诱导海马神经元凋亡的实验研究

摘要

[目的]
　　 Aβ刺激激活原代培养的小胶质细胞，取小胶质细胞条件培养基作用于原代培养的海马神经元，观察Aβ刺激激活小胶质细胞条件培养基对海马神经元的毒性作用，结合本课题组之前关于小胶质细胞等炎性细胞激活及TNFa在AD发病中的作用机制的研究，观察TNF-a、IL-Iβ等细胞因子引起的炎症反应对海马神经元的损伤，探讨小胶质细胞源性炎性反应在AD发病中的可能作用途径和机制，为阿尔茨海默病(AD)的抗炎治疗提供一定的理论依据，及能够为AD的预防和早期治疗提供更有力的细胞学基础。
　　 [方法]
　　 根据本课题组在先前研究中所检测得到Aβ1-42对体外小胶质细胞中TNF-amRNA表达及TNF-a蛋白外分泌量的影响，获得Aβ肽对小胶质细胞的最佳刺激方案，用激活后的小胶质细胞条件培养基作用于原代培养的海马神经元，用western-blot法检测刺激后海马神经元内诱导型一氧化碳合酶和硝基酪氨酸的表达水平，获得最佳刺激方案，用TUNEL法和DNA Ladder凝胶电泳法观察海马神经元的凋亡，同时用激酶活性测定法测定凋亡相关蛋白casepase-3的激活程度。
　　 [结果]
　　 1.利用“无血清培养法”进行原代海马神经元的细胞培养及纯化，用免疫细胞化学及免疫荧光的方法对海马神经元进行鉴定，结果显示，“无血清培养法”能获得高纯度的海马神经元。
　　 2.用Aβ肽处理小胶质细胞取用药24 h之上清来刺激原代培养的海马神经(最佳刺激浓度及时间来源于本课题组先前研究结果)。
　　 3.Western blot法进行检测神经元内iNOS和硝基酪氨酸(nitrotyrosine)的水平，可观察到条件培养基刺激海马神经元6 h，INOS及NT即有少量的表达，随着刺激时间的延长，iNOS和硝基酪氨酸的表达愈明显。
　　 4.TUNEL和DNA电泳鉴定神经元细凋亡程度及刺激前后对照差异，可以观察到，海马神经元出现了明显的凋亡，且随着刺激时间的延长，凋亡率也在增加。
　　 [结论]
　　 1.采用“营养缺失法”，并结合“摇床分离法”能够获得高纯度的小胶质细胞。
　　 2.采用无血清培养法能够获得高纯度的海马神经元细胞。
　　 3.Aβ肽能激活小胶质细胞并能促进原代小胶质细胞促进TNFa蛋白的分泌。
　　 4.激活后的小胶质细胞条件培养基作用于原代培养的海马神经元，能诱导海马神经元凋亡及促进神经元内iNOS和硝基酪氨酸(nitrotyrosine)的表达水平的增高。