南方鲇(Silurus meridionalis)神经肽Y(NPY)基因cDNA克隆及mRNA表达研究

摘要

神经肽Y(Neuropeptide Tyrosing NPY)是由36个氨基酸组成的单链多肽，广泛分布于脊椎动物中枢和外周神经系统。在端脑、视前区、视顶盖及下丘脑含量尤为丰富，在下丘脑内的弓状核、室周核、室旁核、室交叉上核和视交叉后核等区域分布密集。NPY具有调节动物摄食和心血管的功能，参与免疫应答和激素释放，对生殖、肥胖及性逆转等生理过程也有作用。
　　 本研究以南方鲇（Silurus meridionalis）为实验对象，采用RT-PCR和RACE技术，获得南方鲇NPY基因eDNA的全长序列，并对其核苷酸和氨基酸序列及预测的蛋白质结构进行分析;采用qPCR检测了南方鲇各种组织（胃、脑、肠、肾脏、鳃、心脏和肝脏）、发育阶段（受精卵、囊胚期、原肠胚期、神经胚期和出膜后第一次摄食前）和不同摄食条件下NPY mRNA的表达水平，为今后研究NPY在南方鲇的生物学功能提供基础资料。
　　 1、对多种与南方鲇亲缘关系较近鱼类的NPY基因进行多重比对分析，设计简并引物，采用RACE技术扩增获得南方鲇NPYeDNA的全长序列。南方鲇NPY基因eDNA全长743 bp，包括5'非编码区(UTR)82 bp，起始密码子为ATG，开放阅读框(ORF)288 bp，编码95个氨基酸，3'非编码区(UTR)373 bp，终止密码子TGA。
　　 2、南方鲇NPY的cDNA编码的95个氨基酸中，有36个氨基酸成熟肽，27个氨基酸信号肽，一个蛋白水解加工位点Gly-Lys-Arg和29个氨基酸组成NPY的羧基末端旁侧肽段（CPON）。蛋白质一级结构预测显示，分子量为10830.5Da，分子式为C487H754N130O136S7，等电点为6.54。在氨基酸组成上，亮氨酸含量最高占11.6％，其次是丙氨酸，占8.4％，组氨酸含量最低为1.1％。整体分析，碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）和酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）分别占11.7％和10.6％。利用SOPMA软件对NPY的二级结构预测表明，主要由四种形式组成，即α-螺旋、β-折叠、无规卷曲、延伸链。α-螺旋占43.16％，β-折叠占9.47％，无规卷曲占31.58％，延伸链占15.79％，由此可以看出，α螺旋所占的比例最多。
　　 3、与其它脊椎动物进行同源性分析发现，南方鲇NPY氨基酸序列与斑点叉尾鲴（Ictalurus punctatus）的同源性最高，达79％，其次为瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachellii），同源性达76％。与金鱼（Carassius auratus）、中华倒刺鲃（Spinibarbus sinensis）、斑马鱼（Danio rerio）、鲤鱼（Cyprinus carpio）、岩原鲤（Procypris rabaudi）、大西洋鲑（Salmo salar）、鸡（Gallus gallus）、猕猴（Macaca mulatta）和人（Homo sapiens）的同源性分别为69％、66％、66％、65％、65％、53％、57％、61％和61％。进化树分析表明，南方鲇NPY基因与鲇形目的斑点叉尾鮰和瓦氏黄颡鱼首先聚在一起，之后和鲤形目的金鱼、岩原鲤、锦鲤、胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）、斑马鱼聚为一大枝。
　　 4、利用qPCR技术对南方鲇体内各组织NPYmRNA的表达情况进行检测，结果显示，NPY在南方鲇脑、肠、鳃、胃、肾脏、心脏及肝脏等七种组织都有不同程度的表达，在脑中的表达量显著高于其它组织，而在其它组织间差异均不显著。对南方鲇胚胎发育不同时期NPY mRNA的表达情况检测发现，南方鲇NPY mRNA在受精卵、囊胚期、原肠胚期、神经胚期和出膜后第一次摄食前都有不同程度的表达，受精卵表达量较少，出膜后第一次摄食前表达量最高，推测NPY参与南方鲇胚胎发育的调节。通过对南方鲇进行饥饿与重新投喂处理，检测脑组织中NPY的表达变化，结果显示在饥饿24小时到7天之间随饥饿时间的延长，NPY在脑组织中的表达水平显著升高。在饥饿14天后重新投喂，发现投喂后4小时，南方鲇的脑中NPY的表达水平急剧下降。结果表明饥饿会使南方鲇脑中NPY表达水平升高，摄食将会导致NPY表达水平降低，说明NPY参与南方鲇摄食调控。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 南方鲇的研究进展

1．2 NPY的研究进展

1．3 NPY家族

1．4 NPY的结构与分布

1．4．1 NPY的结构

1．4．2 NPY的分布

1．5 NPY的受体

1．6 NPY的生理作用

1．6．1 NPY对摄食的影响

1．6．2 NPY对神经内分泌的调节

1．6．3 NPY对学习记忆和运动行为的调节

1．6．4 NPY对泌尿生殖系统的作用

1．6．5 NPY对代谢性疾病的影响

1．7 NPY的其它生理作用

第2章 引言

2．1 研究的目的和意义

2．2 研究内容

第3章 实验材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 实验鱼

3．1．2 菌株和克隆质粒

3．1．3 试剂和试剂盒

3．1．4 自配试剂

3．1．5 主要实验仪器

3．2 基本实验方法介绍

3．2．1 引物的设计

3．2．2 总RNA的提取

3．2．3 RNA的检测

3．2．4 琼脂糖凝胶电泳

3．2．5 目的片段胶回收

3．2．6 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

3．2．7 目的片段与pMD19-T载体的连接

3．2．8 连接产物的转化

3．2．9 阳性克隆的筛选与鉴定

3．2．10 质粒的提取

3．2．11 合成第一链cDNA

3．3 南方鲇NPY cDNA全长的克隆

3．3．1 南方鲇NPY基因核心片段的克隆

3．3．2 南方鲇NPY基因3’端片段的克隆

3．3．3 南方鲇NPY基因5’端片段的克隆

3．3．4 南方鲇NPY基因全长片段的克隆

3．4 NPY mRNA在南方鲇组织、胚胎发育过程及饥饿处理的表达

3．5 数据分析

3．5．1 测序及生物信息学分析

第4章 结果与分析

4．1 南方鲇NPY基因的克隆及分析

4．1．1 南方鲇NPY核心片段的克隆及分析

4．1．2 南方鲇NPY3’端片段的克隆及分析

4．1．3 南方鲇NPY5’端片段的克隆及分析

4．1．4 南方鲇NPY全长的克隆及分析

4．2 南方鲇NPY基因生物信息学分析

4．2．1 南方鲇NPY蛋白信号肽的预测分析

4．2．2 南方鲇NPY预测蛋白的一级结构分析

4．2．3 南方鲇NPY预测蛋白的二级结构分析

4．2．4 南方鲇NPY预测蛋白的三级结构分析

4．3 南方鲇NPY氨基酸序列同源性及进化树分析

4．3．1 南方鲇NPY氨基酸序列同源性分析

4．3．2 南方鲇NPY氨基酸系统进化树分析

4．4 南方鲇NPY mRNA的组织分布分析

4．5 NPY mRNA在南方鲇胚胎发育过程中的表达分析

4．6 饥饿对南方鲇NPY mRNA的表达分析

第5章 结论

参考文献

附录：缩写词表

致谢

硕士期间发表论文