南方鲇(Silurus meridionalis)Ghrelin基因克隆及其mRNA表达研究

摘要

Ghelin为生长激素促分泌受体第一个内源性配体。是一条N末端第三个氨基酸被脂肪酸链修饰的含有28个氨基酸的核酸多肽,最早是由Kojima在小鼠胃中发现。Ghrelin的发现扩展了它在脊椎动物调节能量动态平衡中的作用,研究硬骨鱼类发现,GRln除在胃中高量表达外,在大脑、胰腺、膀胱、肠和鳃中也广泛表达。这种广泛性表达使其功能呈现多样性,从而呈现出一系列的生物学作用。Ghrelin不仅能够刺激鱼类生长激素的释放,提高摄食量、引起肥胖等生物学作用,还能影响多种激素释放以及调节GH/IGF-1轴。它的生物学作用主要通过与体内的内源性配体生长激素促分泌素受体-1a(GHSR-1a)相结合而实现。
　　 本研究以南方鲇为实验对象,运用RACE(Rapid amplification of cDNA end)技术成功克隆了南方鲇Ghrelin基因cDNA的全长序列,并根据碱基序列翻译出Ghrelin的氨基酸序列,进而预测其蛋白质的基本物理性质及高级结构。另外,本研究还使用荧光定量PCR技术(QRT-PCR)检测南方鲇各种组织(脑、胃、肝、肾、心脏、鳃、肠)、发育阶段(受精卵、囊胚,原肠胚,神经胚和出膜)和不同摄食水平下Ghrelin的表达水平,为后续研究Ghrelin的生物学功能提供理论依据。
　　 通过RACE技术,成功的克隆了南方鲇Ghrelin全长cDNA序列。GhrelincDNA序列全长473bp,包括327bp编码区(ORF),以及一段长度为45bp5'端非翻译区(UTR)和101bp3'端非翻译区。南方鲇Ghrelin成熟肽含有22个氨基酸(“GSSFLSPSQRPQNRGDRKPPRV”)。通过对Ghrelin氨基酸的同源性比对,结果显示成熟Ghrelin多肽的N端要比C端更保守,主要为“GSSFLSP”7个氨基酸,其中“GSSF”4个氨基酸推测可能为Ghrelin的生物活性中心。比对结果还显示Ghrelin氨基酸同硬骨鱼类具有40%-81%的相似性,同哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类具有32%-38%的相似性。在经过由低级向高级的进化过程中,4个位点在硬骨鱼类、两栖动物、爬行类、鸟类和哺乳类依然保留,说明此位点在生命活动中扮演重要的角色。
　　 经过QPCR对南方鲇各组织的表达分析,我们发现Ghrelin在胃、肠中的含量相对较为丰富,这和以往研究Ghrelin在胃的基部产生相一致,从侧面可以反映Ghrelin在摄食过程中可能起到某种生物学作用。对南方鲇不同早期发育时期检测Ghrelin的含量变化发现,在出膜前Ghrelin的含量相对丰富,在其余不同的发育时期均微量表达,并随着时间的推移,呈上升趋势,特别卵黄消耗殆尽出膜前,Ghrelin含量明显升高,说明,南方鲇在出膜后各器官对营养供给做出重要应对机制,为食物由内源性向外源性转变做好准备,Ghrelin在对外源性食物调节作用中起更重要的作用,但调节内源性食物作用有限。对南方鲇不同摄食水平检测发现,在摄食后0小时,Ghrelin含量最高,摄食2小时后迅速降低,此时南方鲇胃中食物几乎还没有消化,我们据此推断,Ghrelin在摄食过程中的生物学作用可能仅为饥饿信号。在南方鲇饥饿48小时后,检测Ghrelin的含量最高,然后随饥饿时间的延长,反而呈下降趋势。经过饥饿2周后,当再摄食4小时候后,Ghrelin含量又迅速降低,再摄食24小时后,Ghrelin的含量恢复到饥饿24小时Ghrelin含量的50%。综上我们推测Ghrelin调节摄食是一个短期调节过程,并且Ghrelin的分泌可能受胃组织结构、生理功能的影响以及分解代谢的抑制等。
　　 综上所述,我们总结如下:Ghrelin全长473bp,成熟肽含有22个氨基酸,推测其生物活性中心为“GSSF”位点,此位点高度保守。Ghrelin在南方鲇的胃中含量最高,并且在仔鱼由内源性食物向外源性食物转换中起重要的作用。在摄食生命活动中,Ghrelin作为一种饥饿信号参与摄食,并且这种饥饿信号是一种短期的,并且Ghrelin的分泌可能受胃组织结构、生理功能的影响以及分解代谢的抑制等。