狭义鲌亚科及其相关类群系统发育关系研究及厚颌鲂遗传多样性分析

摘要

鲌亚科(Cultrinae)是东亚特有鲤科类群之一，有18属64种或亚种，除依氏鱼属（Ischikauia）为日本所特有外，其余属种在中国均有分布。自鲌亚科建立以来，关于其单系性、系统位置和属间系统发育关系等问题一直存在着很大争议。随着分子系统学的兴起与广泛应用，传统形态学定义下的鲌亚科（称之为“狭义鲌亚科Cultrinaesensustricto”）的单系性更是受到越来越多的质疑，随之新形式下的“广义鲌亚科Cultrinaesensulato”也被不断提及，但其所包含的属种范围至今尚无定论。此外，厚颌鲂(Megalobramapellegrini)是鲌亚科、鲂属中局限分布于我国长江上游的一种大型经济鱼类。近年来，由于栖息地环境的剧烈变迁和过度捕捞等人为因素的影响，其资源量呈显著下降趋势，但至今关于该物种群体遗传学方面的研究甚少。因此，本论文的研究内容主要分为两部分:第一部分，我们首次以线粒体基因组全序列为分子标记，在广义鲌亚科的背景下对狭义鲌亚科内部属间的系统发育关系进行探讨，并运用松散分子钟方法估算广义鲌亚科的分化时间;第二部分，我们首先基于454高通量测序技术开发厚颌鲂的多态微卫星标记，并首次采用DNA分子标记(微卫星和线粒体DNA)对厚颌鲂龙溪河群体和球溪河群体的遗传多样性进行评估。本论文的主要研究结论如下:
　　 1.我们共测定鲌亚科6属12种20尾标本及其他鲤科5属5种鱼类标本的线粒体基因组全序列(16，610bp～16，747bp)，并结合从GenBank下载的鲌亚科6属7种、其他鲤科17属21种以及外类群胭脂鱼的线粒体基因组全序列为分子标记，通过对其进行分区(partitioned)与不分区(unpartitioned)处理，采用分区与不分区贝叶斯推断法(BayesianInferencemethod)和最大似然法(MaximumLikelihoodmethod)对狭义鲌亚科11属的系统发育关系进行了重建。同时，采用松散分子钟方法，并以8个化石记录和1个地质事件作为校正点估算广义鲌亚科的起源与分化时间。此外，我们基于PBS参数(PartitionedBremerSupport)对线粒体基因组中不同DNA片段的系统重建能力进行了比较。结果显示:(1)狭义鲌亚科不是一个单系类群，其中，大鳍鱼属和罗碧鱼属不与鲌亚科其他属种聚在一起;其余9属聚为一支，并可划分为3群:鲌群、依氏鱼群和(餐)群，其中，鲌群又可划分为鳊支和鲌支;鲂属、鳊属、华鳊属、鲌属、原鲌属和红鲌属构成鲌群，其中，前三属构成鳊支，后三属构成鲌支，是鲌亚科中的特化类群;依氏鱼属单独为一支，即依氏鱼群;(餐)属和飘鱼属聚为一支，称之为(餐)群，位于鲌亚科的基部位置;(2)将除去大鳍鱼属、罗碧鱼属及梅氏鳊属外的15属重新定义为“狭义鲌亚科”，并与鲴亚科构成姐妹群关系;(3)鲂属、华鳊属和飘鱼属均不是单系群;(4)广义鲌亚科和本研究重新定义的“狭义鲌亚科”分别起源于始新世中期(～43Mya)和渐新世早期(～31.7Mya);(5)线粒体基因组数据的分区策略对解决狭义鲌亚科及其相关类群内部的系统发育关系及提升节点支持率上均无显著效果;(6)线粒体基因组中ND4和ND5基因的系统重建能力最高，而ND4L、ND3、12S和ATP8基因相对最差。
　　 2.我们基于454高通量测序技术开发了厚颌鲂多态微卫星标记，并在其4个近缘种间（鲂、三角鲂、团头鲂、伍氏华鳊）进行了跨种扩增及其多态性检测。主要结果如下:(1)实验设计的53对厚颌鲂微卫星引物中成功扩增出33对，其中26对多态、7对单态;(2)26对多态微卫星标记的平均等位基因数(meanNA)为3.08，平均观测杂合度(meanHo)和期望杂合度（meanHE）分别为0.47和0.51，平均多态信息含量(meanPIC)为0.42;其中，具有高度多态(PIC＞0.5)又未偏离哈迪-温伯格平衡(HWE)，既不存在连锁现象(LD)也没有无效等位基因(nullallele)的微卫星位点有5个(MP15，MP16，MP17，MP32和MP40)，适于后续群体遗传学研究;(3)33对成功扩增的厚颌鲂微卫星引物（26对多态和7对单态）在鲂、三角鲂、团头鲂及伍氏华鳊四个近缘种间均具有较高的跨种扩增率(97.0％～78.8％)和多态率(78.1％～64.3％)。
　　 3.我们同时采用10个多态性相对较高的微卫星标记和两个线粒体DNA标记(cytb&D-loop)对厚颌鲂龙溪河野生群体(LXH)和球溪河野生群体(QXH)的遗传多样性进行了评估。主要结果有:(1)厚颌鲂龙溪河群体与球溪河群体遗传多样性的微卫星分析显示，两个野生群体的遗传多样性均处于中等水平，且两者大小相当（如，LXH∶NA=3.8，Ho=0.63，HE=0.62;QXH∶NA=3.7，Ho=0.64，HE=0.64）;(2)线粒体DNA标记(cytb与D-loop)的评估结果显示，龙溪河群体与球溪河群体的遗传多样性水平均较低，且前者低于后者（如，LXH_cytb:单倍型H=1，单倍型多样度Hd=0.000，变异位点数V=0，核苷酸多样度Pi=0.00000;QXH_cytb:H=2，Hd=0.272，V=4，Pi=0.00097;LXH_D-loop:H=2,Hd=0.239,V=3,Pi=0.00077;QXL_D-loop:H=5,Hd=0.423，V=15，Pi=0.00243）;(3)微卫星标记与线粒体DNA标记（cytb&D-loop）的分子变异方差分析(AMOVA)结果一致显示:厚颌鲂龙溪河群体与球溪河群体间存在着中等程度的遗传分化(Fst=0.083～0.124，P＜0.05)，并且遗传变异主要发生在群体内(87.62％～91.66％)而非群体间。由此可见，目前生活于球溪河水域的野生厚颌鲂较龙溪河水域的厚颌鲂更适合选作人工繁殖的亲本，从而对其种群资源的复壮具有更显著的利用价值。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．鲌亚科鱼类研究进展

1．1 鲌亚科系统位置及其单系性

1．2 鲌亚科鱼类属间系统发育关系

1．3 鲌亚科鱼类地理分布

1．4 鲌亚科鱼类生态学研究概况

1．5 鲌亚科鱼类起源与演化

2．厚颌鲂及其遗传多样性研究

2．1 厚颌鲂繁殖生态学研究

2．2 厚颌鲂种群资源利用现状与保护

2．3 厚颌鲂遗传多样性研究

3．分子标记

3．1 线粒体基因组

3．2 微卫星标记及其在鱼类遗传学中的应用

4．本研究的目的及意义

第2章 狭义鲌亚科及其相关类群系统发育关系研究

1．引言

2．材料与方法

2．1 实验样品

2．2 实验方法

2．3 数据分析

2．4 系统发育分析

2．5 分子钟估算

3．结果

3．1 线粒体基因组特征

3．2 序列分析

3．3 不同分区策略下的系统发育结果比较

3．4 分子系统发育结果

3．5 单基因片段系统发育能力的评估结果

3．6 鲤科鱼类的支系分化时间

4．讨论

4．1 不同分区策略对系统发育分析的影响

4．2 线粒体基因组中单基因片段的系统发育重建能力

4．3 狭义鲌亚科及其相关类群的系统发育关系

4．4 分化时间

5．小结

第3章 基于454高通量测序技术开发厚颌鲂微卫星标记

1．引言

2．材料与方法

2．1 实验样品

2．2 总DNA提取

2．3 基于454测序技术的厚颌鲂基因组测序

2．4 厚颌鲂基因组微卫星数据分析

2．5 微卫星筛选原则

2．6 微卫星引物设计

2．7 微卫星多态性筛选及跨种扩增

2．8 数据分析

3．结果

3．1 厚颌鲂基因组中微卫星含量统计

3．2 厚颌鲂多态性微卫星标记开发

3．3 跨种扩增结果

4．讨论

4．1 基于454测序技术的微卫星标记筛选

4．2 厚颌鲂不同类型微卫星的多态性比较

4．3 无效等位基因

4．4 哈迪-温伯格平衡

4．5 厚颌鲂龙溪河群体遗传多样性分析

4．6 跨种扩增分析

5．小结

第4章 厚颌鲂两个野生群体遗传多样性分析

1．引言

2．材料与方法

2．1 实验样品

2．2 引物设计

2．3 实验方法

2．4 数据分析

3．结果

3．1 厚颌鲂龙溪河群体与球溪河群体的遗传多样性

3．2 厚颌鲂龙溪河群体与球溪河群体间的遗传分化

4．讨论

4．1 遗传标记的选择

4．2 哈迪-温伯格平衡

4．3 遗传多样性

4．4 遗传分化

5．小结

参考文献

致谢

在校期间科研实践情况