利用昆虫免疫负调控因子serpin提高球孢白僵菌毒力

摘要

昆虫病原真菌具有对环境无害、寄主范围广、可在适当时候形成流行病等特点，已被广泛应用于农林害虫及城市卫生昆虫的生物防治。但其致死宿主速度慢(4-14 d)、对环境条件要求高等缺点严重制约了真菌杀虫剂的推广和应用。真菌致病昆虫的过程包括孢子附着昆虫体壁、侵染结构形成、菌丝穿透体壁、真菌在宿主血腔中增殖并击倒宿主几个步骤。在此过程中，昆虫会利用其免疫系统进行积极的防御，产生吞噬、黑化及抗菌肽合成等免疫反应，抑制及清除入侵的病原物。研究表明，Toll信号途径是昆虫应对真菌侵染的主要信号通路。当真菌侵染宿主时，会激活体内的Spaetzle蛋白，进而活化Toll受体，引起相应的免疫反应。该信号途径受到丝氨酸蛋白酶抑制子（serpin）的负调控。在果蝇中，当缺乏serpin(Spn43Ac)时，会引起Toll介导免疫反应的组成性活化。因此，我们设想，将免疫负调控因子serpin导入到昆虫病原真菌中表达，使其在真菌侵染宿主的过程中抑制宿主的免疫反应，提高真菌在宿主中的增殖速度，从而增强真菌的杀虫效果。为此，课题组克隆了果蝇的Spn43Ac基因，构建了相应的真菌表达载体，经遗传转化后获得了球孢白僵菌Bbsp∶Spn43Ac菌株，同时获得大肠杆菌异源表达Spn43Ac蛋白，进行了相应的菌株毒力分析及相关反应机理研究，得到的主要研究结果如下∶
　　1.Bbsp∶Spn43Ac真菌表达载体的构建
　　利用PCR互搭的方法去除果蝇Spn43Ac基因的内含子，获得Spn43Ac的cDNA序列，并将其与球孢白僵菌几丁质酶Bbchit1的信号肽（分泌型）相融合，获得融合基因Bbsp∶Spn43Ac。将该融合基因构建进真菌表达载体，通过农杆菌介导法转入球孢白僵菌中，经筛选及实时定量PCR分析获得Bbsp∶Spn43Ac表达菌株。
　　2.Bbsp∶Spn43Ac菌株生物测定
　　我们以大蜡螟和蚜虫为试虫对转基因菌株进行了毒力测定。在3×107孢子/mL条件下，Bbsp∶Spn43Ac菌株对大蜡螟的半致死时间(LT50)为84 h，较野生型(110h)缩短了24％;以蚜虫为试虫，同样观察到转基因菌株LT50的降低（1×107孢子/mL，98hvs117h)。此外，以大蜡螟为试虫，转基因菌株的半致死浓度(LD50)也较野生型菌株显著降低了2倍(2×107vs6×107)。上述结果表明，在球孢白僵菌中超量表达Bbsp∶Spn43Ac可以显著提高菌株的毒力。
　　3.Bbsp∶Spn43Ac菌株毒力提高机制分析
　　1)表达Bbsp∶Spn43Ac不会影响菌株的生长
　　真菌在宿主体壁上的生长和萌发是其侵染致病的一个关键步骤，在此过程中，真菌会产生蛋白酶降解宿主体壁。Spn43Ac是否会对真菌降解宿主体壁蛋白酶的活性及菌株的生长产生影响呢？我们的结果表明，在球孢白僵菌中表达Bbsp∶ Spn43Ac不会影响真菌在人工培养基及在蝉翅上的萌发与生长。体外实验表明，Spn43Ac蛋白对球孢白僵菌降解体壁蛋白酶CDEP-1的活性也无影响。
　　2)表达Bbsp∶Spn43Ac加快昆虫血淋巴中虫菌体的生长
　　真菌侵染宿主后，能在宿主血腔中以虫菌体的形式存在。显微观察发现，Bbsp∶ Spn43Ac-1菌株在接种后84 h已在大蜡螟血淋巴中大量增殖，但接种野生型菌株后血淋巴中只有少量虫菌体。在侵染后108 h，Bbsp∶Spn43Ac菌株的虫菌体数约为野生型的2.4倍(6.6×106 vs2.8×106)。虫菌体在血淋巴中的大量繁殖，会过度消耗宿主的养分，从而使试虫快速死亡。因此，Bbsp∶Spn43Ac菌株在宿主血腔中的繁殖速度快于野生型菌株，这可能是导致转基因球孢白僵菌菌株毒力提高的因素之一。
　　3)表达Bbsp∶Spn43Ac抑制昆虫血淋巴内酚氧化酶(PO)活性
　　酚氧化酶级联反应是昆虫免疫系统的主要反应之一，本研究检测了在球孢白僵菌中表达Spn43Ac对PO活化的影响。结果显示，注射Bbsp∶Spn43Ac孢子后大蜡螟血淋巴酚氧化酶活性较注射野生型孢子普遍降低。注射后8h，Bbsp∶Spn43Ac菌株处理大蜡螟的酚氧化酶酶活性较野生型处理降低了33％(p＜0.01)。
　　4) GST∶Spn43Ac蛋白对酚氧化酶(PO)活性的影响
　　在大肠杆菌中表达、纯化了GST∶Spn43Ac蛋白。以大蜡螟血淋巴为待测酶液，添加单独的GST蛋白对PO活性无影响，而添加GST∶Spn43Ac蛋白能抑制PO的活化，且蛋白浓度越高，抑制活性越强。但将GST∶Spn43Ac热失活后，抑制活性消失。这表明，添加Spn43Ac蛋白对PO活性有抑制作用，并与蛋白浓度成正比。
　　本研究通过在昆虫病原真菌中表达宿主免疫反应负调控因子，抑制了宿主的酚氧化酶活性，提高了真菌在宿主中的增殖速率，从而增强了菌株毒力。研究结果为利用基因工程改良杀虫真菌菌株和筛选高效毒力因子提供了新的思路。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1．1 昆虫病原真菌的研究概况

1．2 昆虫病原真菌的改良及应用

1．2．1 提高昆虫病原真菌杀虫毒力

1．2．2 提高昆虫病原真菌的抗逆性

1．2．3 改变昆虫病原真菌的寄主范围

1．3 Serpin蛋白超家族的研究进展

1．3．1 简介

1．3．2 Serpin的结构特点

1．3．3 Serpin的生物学功能

1．4 Serpin在昆虫先天免疫系统中的功能

1．4．1 昆虫先天免疫应答

1．4．2 先天性免疫信号通路

1．4．3 酚氧化酶(PO)级联系统介导的昆虫黑化反应

1．5 研究目的和意义

第二章 引言

2．1 研究背景和意义

2．2 技术路线

第三章 材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 供试菌株

3．1．2 生测用虫

3．1．3 质粒载体

3．1．4 主要化学试剂

3．1．5 主要仪器设备

3．1．6 主要缓冲液与配方

3．1．7 主要培养基

3．1．8 实验中使用的引物

3．2 实验方法

3．2．1 Bbsp：Spn43Ac基因超量表达载体的构建

3．2．2 大肠杆菌的转化

3．2．3 农杆菌感受态细胞的制备及转化

3．2．4 农杆菌介导球孢白僵菌的遗传转化

3．2．5 Bbsp：Spn43Ac超量表达菌株的筛选

3．2．6 Bbsp：Spn43Ac基因表达检测

3．2．7 Bbsp：Spn43Ac-1菌株菌落形态的观察

3．2．8 观察Bbsp：Spn43Ac-1菌株在蝉翅上的生长

3．2．9 毒力测定

3．2．10 检测Bbsp：Spn43Ac-1菌株在试虫血淋巴中虫菌体的增殖

3．2．11 原核表达蛋白pGEX-6p-Spn43Ac载体的构建

3．2．12 GST：Spn43Ac蛋白的原核表达及纯化

3．2．13 Western Blot

3．2．14 CDEP-1毕赤酵母的诱导表达

3．2．15 检测GST：Spn43Ac蛋白对蛋白酶CDEP-1的影响

3．2．16 昆虫血淋巴内酚氧化酶(PO)的酶活测定

3．2．17 检测GST：Spn43Ac蛋白对酚氧化酶(PO)活性的影响

3．2．18 统计分析

第四章 结果与分析

4．1 Bbsp：Spn43Ac基因的真菌表达载体构建

4．2 超量表达Bbsp：Spn43Ac转化子的筛选

4．3 Spn43Ac在转化子中的表达分析

4．4 表达Bbsp：Spn43Ac不会影响真菌的生长

4．4．1 Bbsp：Spn43Ac-1菌株的表型分析

4．4．2 表达Bbsp：Spn43Ac不会影响真菌在蝉翅上的萌发及生长

4．4．3 GST：Spn43Ac蛋白不会影响昆虫体壁降解酶CDEP-1的活性

4．5 Bbsp：Spn43Ac-1菌株毒力测定结果

4．6 真菌在昆虫血淋巴中的增殖

4．7 昆虫血淋巴内酚氧化酶(PO)的酶活测定

4．8 GST：Spn43Ac蛋白对酚氯化酶(PO)活性的影响

第五章 讨论

5．1 表达Bbsp：Spn43Ac提高球孢白僵菌毒力

5．2 表达Bbsp：Spn43Ac不会影响菌株的萌发和生长

5．3 表达Spn43Ac抑制昆虫酚氧化酶活性

第六章 结论

参考文献

附录1 英文缩写

附录2 在读期间获得的成果

致谢