甘蓝型油菜组织特异性启动子的分离与鉴定

摘要

甘蓝型油菜(Brassica napus)作为我国最重要的油料作物之一，已成为国产食用植物油的第一大来源，2009年菜籽油已占国产油料作物产油的57％以上，但国内食用植物油自给率不到40％，且南方冬闲田油菜产量和含油量较低、抗性较弱且不适宜机械化操作，而通过基因工程技术分离出具有较高应用价值的启动子来提高油菜抗性和光合效率等性状，逐步扩大和提高其种植面积与产量，为有效解决我国植物油问题具有重要意义。组织特异启动子能专门调控基因在特定的组织部位或器官中表达，不仅可以克服组成型启动子驱动外源基因的非特异持续表达所造成浪费以及特定部位表达量上的不足，还有效避免转基因作物种植中发生的基因逃逸现象，有效的解决了转基因环境安全问题。因此，从甘蓝型油菜中分离和鉴定油菜自身的组织特异性启动子，并研究其转录调控的分子机制，为油菜及其近缘物种的基因功能研究和基因工程改良奠定基础。
　　本研究首先根据拟南芥基因芯片和白菜与甘蓝表达谱数据，筛选在根、茎、叶、花组织中特异表达候选基因，并利用实时荧光定量PCR方法对候选基因进行组织特异性检测和表达模式分析;其次，利用5'RACE技术获得其准确的转录起始位点，通过同源克隆方法获得RO-4、LE-7、FL-1、FL-4和ST-7启动子序列，并利用PlantCARE数据库对其顺式调节元件进行了预测和分析。最后，利用双酶切技术构建其相应的植物表达载体并通过农杆菌介导法遗传转化中油821下胚轴，通过转基因植株验证分析启动子表达的特异性和表达强度。同时为了进一步研究特异启动子中的核心序列位置与功能，分别设计不同长度的启动子片段，采用Gateway克隆技术构建启动子的缺失表达载体，通过花序浸染法转化拟南芥，验证启动子中核心序列的位置及功能。具体结论如下:
　　1.采用生物信息学分析方法从拟南芥基因芯片及白菜与甘蓝表达谱数据中筛选鉴定出24个组织特异表达的候选基因，从24个候选基因中获得了14个组织特异表达基因，qPCR分析结果表明RO-4在根部特异表达、LE-7在叶片特异表达、ST-7在根茎角果皮中特异表达、FL-1和FL-4在花器官特异表达。通过对qPCR检测片段、5'RACE末端及基因5'末端序列测序结果分析证实扩增片段是来自qPCR检测为组织特异表达的候选基因基因，启动子的长度为1305-1566bp（包含5'-UTR序列），转录起始位点分别位于翻译起始位点上游53-269bp，并包含核心启动元件TATA-box及多个增强子元件CAAT-box，另外光响应、胁迫响应和激素响应元件也广泛存在于启动子中。
　　2.克隆获得5个组织特异启动子片段，分别是RO-4(1475bp)、LE-7(1566bp)、FL-1(1372bp)、FL-4(1517bp)和ST-7(1305bp)，利用BamHI和NcoⅠ双酶切将RO-4、LE-7、FL-1和FL-4分别亚克隆到相同酶切位点的粘性末端载体骨架pCAMBIA1305.1上，最终成功构建promoter-GUS载体p1305.1-RO-4P、p1305.1-LE-7P、p1305.1-L-1P和p1305.1-FL-4P;同样利用SacⅠ/NcoⅠ双酶切将ST-7替换pCAMBIA1305.1上的CaMV35S启动子，构建植物表达载体p1305.1-ST-7P。然后将构建的植物表达载体成功转化到农杆菌菌株GV3101中获得工程菌株。
　　3.将构建的植物表达载体p1305.1-RO-4P和p1305.1-LE-7P通过下胚轴浸染法遗传转化甘蓝型油菜DH系中油821，经多重PCR鉴定，成功获得p1305.1-RO-4P和p1305.1-LE-7P转基因阳性植株，GUS组织化学染色证实LE-7启动子主要在叶片中表达，在花和花蕾、根、角果皮中基本上不表达;RO-4启动子在叶片边缘表达，其他部位因生长情况还未检测。
　　4.克隆获得6个RO-4缺失启动子，分别是R1(1301bp)、R2(1030bp)、R3(622bp)、R4(481bp)、R5(352bp)和R6(252bp);5个E-7P缺失启动子即L1、L2、L3、L4和L5，长度分别为925bp、755bp、526bp、350bp和231bp。分别与表达载体质粒pMDC162进行LR重组反应构建了相应片段的缺失表达载体，并成功转入农杆菌菌株GV3101，获得工程菌株。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 植物启动子概述

1．2 启动子的结构与分类

1．2．1 启动子的结构

1．2．2 启动子的分类

1．3 植物组织特异性启动子的研究动态

1．3．1 种子特异启动子

1．3．2 根特异启动子

1．3．3 花粉或花药特异启动子

1．3．4 维管组织特异性启动子

1．3．5 叶片特异启动子

1．3．6 其他组织器官特异启动子

1．4 植物启动子的研究方法

1．5 甘蓝型油菜组织特异启动子的研究进展

1．6 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 质粒与菌株

2．2 仪器设备与试剂

2．2．1 PCR反应引物

2．2．2 重要实验设备

2．2．3 主要实验试剂

2．2．4 自配试剂

2．3 实验方法与步骤

2．3．1 核酸提取及cDNA的合成

2．3．2 目的片段的亚克隆和测序

2．3．3 甘蓝型油菜组织特异表达基因的筛选和基因表达模式检测

2．3．4 甘蓝型油菜组织特异基因表达5'RACE克隆

2．3．5 甘蓝型油菜组织特异启动子表达载体的构建

2．3．6 农杆菌介导的表达载体转化甘蓝型油莱

2．3．7 转基因植株分子检测及GUS组织化学染色鉴定

2．3．8 启动子缺失载体构建

3 结果与分析

3．1 组织特异表达候选基因筛选

3．2 特异表达基因组织特异性检测

3．3 特异表达基因5'RACE克隆

3．4 甘蓝型油菜组织特异启动子片段的克隆

3．4．1 甘蓝型油菜根特异启动子RO-4扩增与序列分析

3．4．2 甘蓝型油菜叶片特异启动子LE-7扩增与序列分析

3．4．3 甘蓝型油菜花特异启动子FL-1扩增与序列分析

3．4．4 甘蓝型油菜花蕾特异启动子FL-4扩增与序列分析

3．4．5 甘蓝型油菜根、茎秆和角果皮特异启动子ST-7扩增与序列分析

3．5 甘蓝型油莱组织特异启动子promoter-GUS表达载体构建

3．5．1 植物表达载体pCAMBIA1305．1骨架的制备

3．5．2 双酶切构建甘蓝型油菜组织特异启动子表达载体

3．5．3 重组载体转化根瘤农杆菌及鉴定

3．6 p1305．1-RO-4P和p1305．1-LE-7P载体遗传转化甘蓝型油菜及转基因植株鉴定

3．6．1 甘蓝型油菜的遗传转化

3．6．2 转基因再生植株的PCR检测

3．6．3 转基因再生植株的组织化学染色

3．7 缺失载体的克隆

4 讨论

4．1 组织特异表达候选基因的获取

4．2 启动子顺式元件预测分析

4．3 启动子的promoter-GUS载体的构建

4．4 通过根癌农杆菌介导法转化甘蓝型油菜获得转基因植株

4．5 RO-4启动子和LE-7启动子表达的时空性

4．6 构建RO-4和LE-7缺失启动子的意义

5 主要结论

参考文献

主要缩略词

致谢

硕士学习期间发表论文

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