蜡蚧转枝菌(Verticillum lecanii)对柑橘粉虱子(Diaelorude citri)基因表达的影响

摘要

柑橘粉虱(Diaelorude citri Asahmaed)分布广，寄主多，食性杂，可危害柑橘及桃、柿、苦楝等30余种植物，造成严重的经济损失。由于若虫和蛹表面有蜡质保护，且该虫一年发生多代、易对杀虫剂产生抗性，所以具有一定的防治难度。蜡蚧轮枝菌（Verticillium lecanii）分布广，防效好，寄生率高，是防治柑橘粉虱的有效虫生真菌。目前关于柑橘粉虱免疫机制方面的报道很少，为了从分子水平上阐明柑橘粉虱防御蜡蚧轮枝菌的分子免疫机理，我们应用高通量测序技术(Illumina HiSeqTM2000)测定了柑橘粉虱转录组，在此基础上，运用数字基因表达谱技术比较了蜡蚧轮枝菌处理组及敏感组间基因表达差异。本研究主要结论如下:
　　1、蜡蚧轮枝菌培养基筛选
　　通过以生长速率和产孢量为指标，筛选出适宜蜡蚧轮枝菌生长的培养组分及其配比。当培养组分为:12％乳糖、0.05％胰蛋白胨、0.03％ FeSO4·7H2O、0.01％VB1时，蜡蚧轮枝菌菌落长势最好。而当培养组分为2％乳糖、0.4％胰蛋白胨、0.03％ FeSO4·7H2O、0.01％ VB1时，蜡蚧轮枝菌产孢速度最快。
　　2、柑橘粉虱转录组数据组装
　　通过高通量Illumina测序，获得柑橘粉虱reads24，071，734条，通过序列之间的overlap信息组装得到2，318，371条平均长度为82bp的contig，运用成对的reads对以上组装的contig进行拼接和填补，得到119，428条平均长度为952bp的transcripts。进一步组装transcripts后，获得平均长度为772bp的unigene84，733条。
　　3、柑橘粉虱转录组信息学分析
　　将Unigene比对到nr、GO、COG、KEGG和swissprot等数据库中，共有28，190条基因获得功能注释，其中获得GO功能注释的Unigene有17，081条，获得COG成功注释的Unigene11，516条，9，387条Unigene得到KEGG的功能注释，获得nr功能注释的有27，746条。
　　4、柑橘粉虱免疫相关基因分析
　　从组装的Unigene中鉴定出与柑橘粉虱免疫防御相关的基因210条Unigene，包括(1)模式识别受体:清道夫受体基因8条，乳糖凝集素基因5条，C类凝集素3条，肽聚糖识别受体及革兰氏阴性菌结合蛋白基因各1条;(2)信号传导因子:丝氨酸蛋白酶基因46条，丝氨酸蛋白酶抑制因子基因16条，Toll受体基因20条;(3)效应因子:含硫脂蛋白基因26条，酚氧化酶原基因18条，溶菌酶和抗菌肽基因各3条;(4)其他因子:过氧化氢酶基因17条，酯酶基因15条，过氧化物酶基因11条，超氧化物歧化酶基因9条，半胱天冬酶基因2条。
　　5、蜡蚧轮枝菌侵染柑橘粉虱的差异表达基因分析
　　分析蜡蚧轮枝菌侵染前后柑橘粉虱的数字基因表达谱发现，与对照相比，1天组和7天组分别获得差异倍数大于1且FDR小于0.001的差异表达基因213条、676条。1天组和7天组中同时得到GO和pathway显著富集的差异表达基因分别为29和28条。1天组的差异表达基因中，昆虫储存蛋白基因、受体介导的内吞基因、热激蛋白基因及抗菌肽基因等免疫基因的上调倍数较高。在7天组中，溶酶体基因的上调倍数较高，此外我们还发现了5条上调倍数较高的新基因，这些差异基因很有可能在柑橘粉虱免疫防御蜡蚧轮枝菌的过程中起着重要的作用，这些数据能为今后深入研究分子免疫机制提供了宝贵的基因资源。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1 柑橘粉虱的危害及防治

1．1 柑橘粉虱的生物学特性及危害

1．2 柑橘粉虱的防治情况

2．昆虫免疫机制

2．1 体壁防御

2．2 非己识别

2．3 免疫信号的调整放大和信号传导

2．4 免疫效应

第二章 引言

第三章 蜡蚧轮枝菌培养基筛选

3．1 材料与方法

3．1．1 试剂与仪器

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 不同碳源对菌落长势及产孢量的影响

3．2．2 不同氮源对菌落长势及产孢量的影响

3．2．3 不同碳源比例对菌落长势及产孢量的影响

3．2．4 不同氮源比例对菌落长势及产孢量的影响

3．2．5 不同金属离子比例对菌落长势及产孢量的影响

3．2．6 不同维生素比例对菌落长势及产孢量的影响

3．3 讨论

第四章 柑橘粉虱转录组测序及分析

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 总RNA提取结果

4．2．2 Illumina测序以及组装

4．2．3 GO分类，COG及Pathway功能注释

4．2．4 亲缘性分析

4．2．5 E value distribution分析

4．2．6 SSR及ORF分析

4．3 讨论

第五章 柑橘粉虱免疫相关基因分析

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．1．3 进化分析

5．2 结果与分析

5．2．1 柑橘粉虱免疫系统相关基因的鉴定

5．2．2 Toll相关受体基因的系统发育分析

5．2．3 酚氧化酶原基因的系统发育分析

5．2．4 丝氨酸蛋白酶及同源物基因的系统进化分析

5．2．5 几丁质酶及几丁质合成酶

5．2．6 氧化防御相关基因

5．3 讨论

第六章 蜡蚧轮枝菌侵染柑橘粉虱的差异表达基因分析

6．1 材料与方法

6．1．1 材料

6．1．2 方法

6．2 结果与分析

6．2．1 RNA提取及处理

6．2．2 柑橘粉虱数字基因表达谱测序结果

6．2．3 测序质量评估

6．2．4 差异表达基因

6．2．5 GO显著富集分析

6．2．6 pathway显著富集分析

6．3 讨论

第七章 结论

参考文献

致谢

发表论文和参加的项目