茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根的生长及次生代谢产物产生的影响

摘要

茄科曼陀罗属的曼陀罗(Datura stramonium L.)是重要的药用植物。近年来，随着对东莨菪碱药理作用的深入研究和广泛应用，围绕曼陀罗进行的研究很多，而通过诱导子刺激毛状根中次生代谢产物的迅速积累又是其中的研究热点。本文以发根农杆菌C58C1菌种（C58C1是根癌农杆菌经“Disarmed”改造后，保留Helper质粒，导入pRiA4质粒而成的发根农杆菌）和曼陀罗(Datura stramonium L.)叶片为材料，经过侵染、共培养、除菌、扩大培养等过程得到曼陀罗毛状根培养体系，以此为基础，测定其生长动态曲线及东莨菪碱和莨菪碱合成动态变化，再分别采用浓度诱导和时间诱导，研究茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根生长、逆境生理特性和主要次生代谢产物含量的影响，对获得价格昂贵的天然药物东莨菪碱和莨菪碱具有重要的理论意义和应用前景，主要研究结论如下:
　　1.本实验首先利用发根农杆菌C58C1侵染曼陀罗叶片，共培养5d后，光照培养10 d左右，诱导得到曼陀罗毛状根。经过观察，曼陀罗毛状根在1/2 MS液体培养基中生长良好，生长速度较快，于是实验扩大培养时，均采用1/2 MS液体培养基进行曼陀罗毛状根的增殖培养。经过除菌和扩大培养后，最终得到良好的曼陀罗毛状根培养体系。培养所得曼陀罗毛状根成圆形团块状，这应是与培养时所用圆底烧瓶形状和摇床的规律性圆周转动有关。而且，圆形团块状毛状根的中间部位颜色较深，越向外其颜色越浅，中间的深色部位是由老根形成，而周围颜色较浅的毛状根是生长出来的新根。
　　2.实验对曼陀罗毛状根悬浮培养的一些基本特性做了研究。结果表明，曼陀罗毛状根生长曲线存在延迟期(0-18 d)，之后便进入快速生长期(18-27 d)，27 d达生长高峰期，30 d达生长稳定期，之后毛状根生长减缓，趋于平稳后逐渐下降。曼陀罗毛状根中，东莨菪碱和莨菪碱的合成量随着毛状根培养时间的增加而增加，当曼陀罗毛状根在培养27 d左右，毛状根中东莨菪碱和莨菪碱的合成量达到最大值，在30 d左右，即毛状根生长的稳定期后，东莨菪碱和莨菪碱合成明显减慢，且含量降低。实验结果说明曼陀罗毛状根的生长高峰期与生物碱合成高峰期一致，均在27 d左右，鉴于曼陀罗毛状根的生长和主要次生代谢产物合成量，实验中加入诱导子时间选择在培养18d后，此时进行后期诱导试验效果最佳。
　　3.实验中探讨了茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根生长及逆境生理特性各指标的影响。由实验结果可以看出茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根生长有抑制作用。经不同浓度的MJ进行诱导处理后，曼陀罗毛状根根尖出现变黄和褐化现象，其鲜重和干重及其增殖倍数都明显低于对照。在五个浓度处理中，用200μmol·L-1MJ对曼陀罗毛状根进行诱导处理的鲜重增殖倍数和干重增殖倍数均高于其他几个处理，因此考虑用浓度为200μmol·L-1的MJ进行时间梯度诱导处理。曼陀罗毛状根经浓度为200μmol·L-1的MJ处理后，生长高峰期提前3d出现，处理后的毛状根干、鲜重均明显低于未添加MJ的对照毛状根干、鲜重。经诱导子MJ处理后，曼陀罗毛状根的O2-、可溶性蛋白质、MDA指标、脯氨酸含量均有不同程度的增加或先增加后降低的趋势;SOD活性先出现增高趋势，随着培养时间的延长，SOD酶的活性也随之降低而趋于稳定;POD呈现先上升再下降后趋于稳定;CAT活性呈现先降低后升高再降低后趋于稳定，且3种保护酶活力变化与诱导浓度和诱导时间有关。结果说明，MJ对曼陀罗毛状根氧化酶活性有影响，能较好地刺激曼陀罗毛状根保护酶活力的增强，有利于主要次生代谢产物成分的合成积累。
　　4.实验结果表明，茉莉酸甲酯能有效提高莨菪烷类生物碱成分在曼陀罗毛状根中的积累并刺激其向培养基中释放。MJ能显著促进曼陀罗毛状根中东莨菪碱成分的积累并向培养基中释放，能显著促进处理3d和6d后曼陀罗毛状根中莨菪碱成分的积累并向培养基中释放。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 曼陀罗

1．1．1 曼陀罗的生物学特性

1．1．2 曼陀罗的主要化学成分

1．1．3 曼陀罗的药理作用

1．1．4 曼陀罗的组织培养

1．2 毛状根

1．2．1 毛状根的诱导

1．2．2 毛状根的特点

1．2．3 毛状根中次生代谢产物

1．2．4 对毛状根次生代谢产物形成产生影响的因素

1．2．5 毛状根培养技术的应用和展望

1．3 曼陀罗毛状根的研究进展

1．4 诱导子

1．4．1 诱导子的种类

1．4．2 诱导子的作用机制

1．4．3 诱导子作用的特点

1．4．4 茉莉酸甲酯的研究进展

第二章 绪论

2．1 本研究的目的与意义

2．2 研究内容

2．3 技术路线

第三章 曼陀罗毛状根培养体系的建立

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果分析

3．3．1 曼陀罗毛状根培养体系的建立

3．3．2 曼陀罗毛状根中VirD基因检测

3．3．3 曼陀罗毛状根的rolB基因检测

3．4 讨论

第四章 曼陀罗毛状根悬浮培养生长特性的研究

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 曼陀罗毛状根的悬浮培养

4．2．2 毛状根鲜重、干重测定方法

4．2．3 曼陀罗毛状根主要次生代谢产物含量测定方法

4．3 结果分析

4．3．1 曼陀罗毛状根悬浮培养生长曲线

4．3．2 曼陀罗毛状根悬浮培养主要次生代谢产物含量变化

4．4 讨论

第五章 茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根生长及逆境生理特性的影响

5．1 引言

5．2 材料和方法

5．2．1 曼陀罗毛状根的培养

5．2．2 茉莉酸甲酯溶液的制备

5．2．3 曼陀罗毛状根鲜重、干重测定方法

5．2．4 曼陀罗毛状根逆境生理特性测定方法

5．2．5 诱导方案

5．3 结果分析

5．3．1 茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根生长的影响

5．3．2 茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根逆境生理特性的影响

5．4 讨论

第六章 茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根主要次生代谢产物含量的影响

6．1 引言

6．2 材料和方法

6．2．1 曼陀罗毛状根的培养

6．2．2 茉莉酸甲酯溶液的制备

6．2．3 曼陀罗毛状根中东莨菪碱、莨菪碱的提取及测定方法

6．2．4 培养基中东莨菪碱、莨菪碱的提取及测定方法

6．2．5 诱导方案

6．3 结果分析

6．3．1 茉莉酸甲酯浓度对曼陀罗毛状根中主要莨菪烷类生物碱成分积累和释放的影响

6．3．2 茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根东莨菪碱、莨菪碱积累的影响

6．3．3 茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根东莨菪碱、莨菪碱释放的影响

6．3．4 茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根总东莨菪碱和总莨菪碱合成的影响

6．4 讨论

第七章 结论

参考文献

致谢

在校期间发表的论文