柑橘果实快速高效在线抗氧化活性评价方法的建立及其应用研究

摘要

人类许多疾病的发生与人体自身抗氧化活性系统能力的强弱存在着直接或间接的关系。同样，食品的氧化变质也和食品抗氧化活性密切相关。人体可以通过摄入抗氧化物质来增强自身的抗氧化系统能力。在食品中可以通过添加人造或天然抗氧化物质，来延长食品的保鲜期和货架期。抗氧化物质的种类包括人造抗氧化剂和天然抗氧化剂。人造抗氧化剂被质疑可能会危害人体健康，其安全性长期以来具有较大争议。所以寻找天然的抗氧化活性物质和具有抗氧化活性的植物种类，成为目前抗氧化活性研究的热点。柑橘作为世界上最重要的果树作物之一，其果实中许多生物活性物质具有的抗氧化活性。到目前为止，已经建立了许多检测抗氧化活性的方法，例如DPPH、ABTS、FRAP、ORAC等离线法，以及HPLC-DPPH和HPLC-ABTS等在线法。然而离线法在一定程度上存在操作繁琐，耗时耗力等问题;而已有的在线法侧重于分析样品中单个化合物的抗氧化活性研究，不能快速直接测定样品的总抗氧化活性。但是样品总抗氧化活性测定往往是许多研究的第一步。实现总抗氧化活性快速化测定，对于抗氧化活性及其相关研究都具有重要的意义。因此，建立快速高效抗氧化活性分析检测方法，将促进抗氧化活性的实验研究，有利于实现植物资源抗氧化活性系统快速地评价，同时对食品抗氧化活性的快速检测等都具有重要的意义。
　　本论文旨在建立和应用快速高效在线抗氧化活性检测方法。我们将高效液相色谱系统（英文全称High Performance Liquid Chromatograpy，简称HPLC）和柱后不同自由基检测系统（英文全称Free Radical Scavenger Detector，简称FRSD）联用，并优化了检测系统的实验条件。利用柱后系统研究两种自由基（DPPH和ABTS自由基）的清除效果，以建立两种抗氧化活性检测方法（HPLC-DPPH-FRSD法和HPLC-AB S-FRSD法）。并对HPLC-FRSD在线抗氧化活性检测系统进行方法学验证。在上述工作的基础上，本研究利用新在线HPLC-DPPH/ABTS-FRSD检测系统测定了35个不同基因型柑橘成熟果实的果皮、囊衣、种子和果汁的抗氧化活性，分别与离线DPPH法和ABTS法测定的抗氧化活性结果进行相关性分析，评价在线HPLC-FRSD检测系统在是否适用于不同基质样品抗氧化活性的快速测定。同时，我们还分析了在线HPLC-FRSD检测系统是否能用于柑橘抗氧化活性与柑橘总酚总黄酮含量相关性研究。新的快速高效总抗氧化活性检测方法的建立和已有在线HPLC抗氧化活性检测方法比较，是一种技术的进步，对未来柑橘资源的评价和柑橘果品营养学研究有重要的理论和实践价值。论文主要研究结果如下:
　　1.在线HPLC-FRSD抗氧化活性检测系统的建立
　　1.1柑橘酚类标准物质单体抗氧化活性的比较
　　为了筛选出作为新建在线HPLC-FRSD系统中的抗氧化标准物质，本章节通过DPPH法，ABTS法和FRAP法三种离线法，以及已经报道的HPLC-DPPH法和HPLC-ABTS法测定了15种常见柑橘酚类物质的抗氧化活性，并利用抗氧化活性综合指数(Antioxidant potencycomposite，APC)评价其抗氧化活性。
　　结果显示15种柑橘酚类物质的抗氧化活性顺序（APC综合评价指数，％）为:没食子酸(92.32％)＞咖啡酸(85.29％)＞绿原酸(69.75％)＞阿魏酸(50.97％)＞圣草酚(39.38％)＞圣草次苷(39.36％)＞芦丁(27.42％)＞橙皮素(4.88％)＞柚皮素(4.78％)＞地奥司明(3.24％)＞橙皮苷(2.33％)＞川陈皮素(1.18％)＞甜橙黄酮(1.16％)、柚皮苷(1.16％)＞橘皮素(0.41％)。
　　基于上述结果，综合考虑酚类物质抗氧化活性强弱以及来源方便与否，选用芦丁、阿魏酸、没食子酸、绿原酸和咖啡酸共5种酚类物质为抗氧化标准物质，用于新在线HPLC-FRSD抗氧化活性检测系统建立。
　　1.2 HPLC-FRSD在线抗氧化活性检测系统优化
　　为了建立新在线抗氧化活性检测方法，实现对样品的抗氧化活性快速测定，本论文通过对HPLC-FRSD在线抗氧化活性检测系统条件的优化，最终确立HPLC-DPPH/ABTS-FRSD法分析检测的条件如下:
　　(1) HPLC分析系统:配有Waters XTerra MS C18保护柱芯(3.9×20 mm，5μm);流动相:A为0.1％（V醋酸∶V水=1∶999）醋酸水溶液，B为甲醇;等度洗脱程序条件:37％A，63％B;流速:0.91 mL min-1;保护柱柱温:30℃;进样体积25μL; PAD检测波长:2D通道分别设置283 nm和245 nm。(2)柱后分析系统:DPPH自由基溶液(0.2 mM)或ABTS自由基溶液（400 nm处吸光度为0.70±0.02 AU时的浓度）引入流速均为0.80 mL min-1。DPPH自由基溶液检测波长517 nm; ABTS自由基溶液检测波长为400 nm;柱后自由基衍生反应系统温度为30℃。每个样品抗氧化活性分析时间为5 min。(3)整个系统是由Waters EmpowerTM2 Chromatography（美国Waters公司）数据分析软件控制。(4)最后样品抗氧化活性利用维生素C标准曲线以及换算成维生素C当量进行表示[mg g-1干重(DW)或mg L-1鲜重(FW)]。
　　1.3 HPLC-FRSD在线抗氧化活性检测系统验证
　　为了对新建立的HPLC-FRSD抗氧化活性检测系统进行方法学验证，我们利用芦丁等酚类标准物质单体对新系统的检出限，定量限，回收率，重复性，精确性和稳定性进行了考察。研究结果表明:我们建立的在线HPLC-DPPH-FRSD和HPLC-ABTS-FRSD两种检测方法，均呈现很好的线性度(r＜0.999)，具有低的检出限（0.001-0.010 mg mL-1）和定量限(0.005-0.020mg mL-1)，具有高的回收率(90.44-115.72％)，良好的重复性(RSD＜2％)、精密度(RSD＜2％)和稳定性（7小时内RSD＜15.80％）。有关参数验证结果完全符合方法学要求。
　　2.在线HPLC-FRSD系统应用于柑橘果实抗氧化活性测定的研究
　　为了研究在线HPLC-FRSD系统是否适用于柑橘样品不同基质抗氧化活性高效快速测定，我们用新建立的HPLC-DPPH/ABTS-FRSD方法测定8大种类共35个不同基因型柑橘成熟果实不同部位的抗氧化活性，并与离线DPPH法和ABTS法测定的柑橘抗氧化活性结果进行相关性分析。研究结果表明，在线法和离线法用于柑橘果实抗氧化活性测定，两者存在显著相关性(P＜0.05)，在线抗氧化活性检测方法适合柑橘不同基质样品的快速高效抗氧化活性检测。其中HPLC-ABTS-FRSD法适用于柑橘囊衣、种子、果汁快速抗氧化活性测定;HPLC-DPPH-FRSD法适用于柑橘果皮、种子、果汁快速抗氧化活性测定。在线HPLC-FRSD抗氧化活性检测系统可以快速和高通量测定不同基质的柑橘样品。
　　3.在线HPLC-FRSD系统应用于柑橘果实抗氧化活性测定与总酚总黄酮含量相关性研究
　　柑橘果实的抗氧化活性，源于其所具有的抗氧化物质。本文通过福林酚法和氯化铝显色法分别测定了柑橘果实的总酚含量和总黄酮含量，进一步研究了在线HPLC-FRSD系统是否适用于柑橘果实抗氧化活性测定与总酚总黄酮含量相关性研究。结果表明:HPLC-DPPH-FRSD法可以替代DPPH离线法应用于柑橘果实抗氧化活性与总酚总黄酮含量相关性分析研究;HPLC-ABTS-FRSD法可以替代ABTS法应用于柑橘果皮和果汁抗氧化活性与总酚总黄酮含量相关性研究。
　　4.柑橘果实不同部位抗氧化活性，总酚总黄酮含量测定结果
　　4.135个不同基因型柑橘成熟果实不同部位抗氧化活性测定结果
　　抗氧化活性较高的柑橘果皮样品包括:桠柑3号和牛肾柑;囊衣样品包括:枸头橙;种子样品包括:枸头橙、口之津15号（蜜可露）、卡拉橘;果汁样品包括:岭南沙田柚、专有橘、帕森橘（墨西哥）、白橘。抗氧化活性较弱的柑橘样品包括沙柑的种子和果汁、郭2701-1黎檬的果汁、兰卜株檬的果汁、囊衣和种子。一般来讲，35个不同基因型柑橘成熟果实不同部位相比较，果皮和果汁的抗氧化活性最高，柑橘果皮和果汁是潜在的柑橘果实主要抗氧化活性贡献者。
　　4.235个不同基因型柑橘成熟果实不同部位总酚含量测定结果
　　果皮样品总酚含量较高的有枸头橙和代代;囊衣样品总酚含量较高的有枸头橙和代代;种子样品总酚含量较高的有口之津15号（蜜可露）、卡拉橘、红马叙葡萄柚、槾橘、瑞红葡萄柚;果汁样品总酚含量较高的有牛肾柑、枸头橙、椪柑3号和红马叙葡萄柚。
　　4.335个不同基因型柑橘成熟果实不同部位总黄酮含量测定结果
　　柑橘果皮样品中总黄酮含量较高的有枸头橙、代代、瑞红葡萄柚;囊衣样品中总黄酮含量较高的有枸头橙、星路比葡萄柚(79-55)、代代、红马叙葡萄柚、朱栾;种子样品中总黄酮含量较高的有卡拉橘、白橘、早香;果汁样品中总黄酮含量较高的有瑞红葡萄柚和枸头橙。

目录

论文说明

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 柑橘生物活性物质种类与分布

1．1．1 柑橘酚类物质种类与分布

1．1．2 柑橘类柠檬苦素种类与分布

1．1．3 柑橘香豆素化合物种类与分布

1．1．4 柑橘类胡萝卜素种类与分布

1．2 柑橘果实抗氧化活性研究

1．2．1 柑橘生物类黄酮抗氧化活性研究

1．2．2 柑橘酚酸类物质抗氧化活性研究

1．2．3 柑橘类柠檬苦素抗氧化活性研究

1．2．4 柑橘香豆素抗氧化活性研究

1．2．5 柑橘类胡萝卜素抗氧化活性研究

1．3 抗氧化活性评价指标

1．4 抗氧化活性评价方法

1．4．1 传统抗氧化活性评价方法

1．4．2 在线抗氧化活性评价方法

第2章 引言

2．1 研究目的和意义

2．2 研究主要内容

2．3 研究思路和技术路线

第3章 HPLC-FRSD在线抗氧化活性检测系统的建立

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验主要仪器与设备

3．1．4 酚类标准物质抗氧化活性测定所需溶液的制备

3．1．5 HPLC-FRSD系统建立所需溶液的配制

3．1．6 酚类标准物质单体抗氧化活性的测定

3．1．7 HPLC-FRSD在线抗氧化活性检测系统优化

3．1．8 HPLC-FRSD在线抗氧化活性检测系统的方法学验证

3．1．9 实验数据处理与分析

3．2 结果与分析

3．2．1 酚类标准物质单体的抗氧化活性分析

3．2．2 HPLC-FRSD抗氧化活性检测系统的优化

3．2．3 在线I-IPLC-FRSD抗氧化活性检测系统的验证

3．3 讨论

3．3．1 酚类标准物质抗氧化活性分析

3．3．2 HPCL-FRSD在线抗氧化活性检测系统的优化

3．3．3 HPCL-FRSD在线抗氧化活性检测系统的验证

3．3．4 HPLC-ABTS-FRSD法和HPLC-DPPH-FRSD法的比较

3．3．5 HPLC-FRSD在线抗氧化活性检测系统优缺点

3．4 小结

3．4．1 酚类物质单体抗氧化活性的比较

3．4．2 HPLC-FRSD在线抗氧化活性检测系统优化

3．4．3 HPLC-FRSD在线抗氧化活性检测系统的验证

第4章 HPLC-FRSD系统应用于柑橘抗氧化活性测定

4．1 实验材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验主要试剂、仪器和设备

4．1．3 柑橘样品的处理与提取

4．1．4 标准品以及自由基溶液配制

4．1．5 基于在线HPLC-FRSD系统柑橘抗氧化活性测定

4．1．6 基于离线DPPH和ABTS自由基法柑橘抗氧化活性测定

4．1．7 实验数据处理与分析

4．2 结果和分析

4．2．1 基于在线法和离线法柑橘果皮抗氧化活性测定及相关性

4．2．2 基于在线法和离线法柑橘囊衣抗氧化活性测定及相关性

4．2．3 基于在线法和离线法柑橘种子抗氧化活性测定及相关性

4．2．4 基于在线法和离线法柑橘果汁抗氧化活性测定及相关性

4．2．5 基于在线法和离线法柑橘果实不同部位抗氧化活性的比较

4．3 讨论

4．3．1 基于在线法和离线法柑橘果实不同部位抗氧化活性测定及相关性分析

4．3．2 基于在线法和离线柑橘果实不同部位抗氧化活性测定的比较

4．3．3 在线HPLC-DPPH／ABTS-FRSD法和离线法比较

4．3．4 HPLC-FRSD系统应用于柑橘抗氧化活性测定研究

4．3．5 HPLC-FRSD系统潜在应用价值

4．4 小结

第5章 HPLC-FRSD系统应用于柑橘抗氧化活性与总酚总黄酮含量相关性研究

5．1 实验材料与方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验试剂

5．1．3 实验主要仪器和设备

5．1．4 柑橘样品处理与提取

5．1．5 柑橘果实不同部位总酚含量的测定

5．1．6 柑橘果实不同部位总黄酮含量测定

5．1．7 实验数据处理与分析

5．2 结果与分析

5．2．1 柑橘果实不同部位总酚含量分析

5．2．2 柑橘果实不同部位总黄酮含量测定

5．2．3 新在线法与离线法的抗氧化活性总酚总黄酮相关性结果一致性

5．3 讨论

5．3．1 氯化铝显色法和硝酸铝显色法测定总黄酮含量比较

5．3．2 成熟柑橘果实总酚总黄酮含量测定

5．3．3 柑橘抗氧化活性和总酚总黄酮含量相关性

5．3．4 HPLC-FRSD系统应用于柑橘抗氧化活性与总酚总黄酮含量相关性研究

5．4 小结

第6章 结论及展望

6．1 研究结论

6．2 本研究主要特色和创新点

6．3 展望

参考文献

附录 缩略词表

(续)附录 缩略词表

致谢

作者简历及在读期间所取得的科研成果