尼罗罗非鱼两种芳香化酶(Cyp19a1a和Cyp19a1b)表达与功能的初步研究

摘要

多数研究表明雌激素在鱼类性别决定、卵巢分化与维持的过程中均起到决定性作用。芳香化酶是雌激素合成的限速酶，硬骨鱼类有两种芳香化酶，即卵巢芳香化酶（cyp19a1a）和脑芳香化酶（cyp19a1b），已有研究主要针对cyp19a1a在性腺以及cyp19a1b在脑的表达与作用，而少有研究聚焦于cyp19a1a在脑、cyp19a1b在性腺的表达与作用。另外，现有的研究多数是通过芳香化酶活性抑制剂或者雌激素受体拮抗剂等间接的手段来证明雌激素在鱼类性别决定、卵巢分化与维持中的作用，而几乎没有通过缺失功能(loss of function)或者获得功能(gain of function)对两种芳香化酶在性别决定与分化中的作用进行研究。尼罗罗非鱼（Oreochromisniloticus）是世界性养殖鱼类，雄鱼比雌鱼生长快50％，易获得单性鱼苗，其基因组序列已经公开，本实验8个性腺转录组数据测序相继完成，所以尼罗罗非鱼是研究性别决定与分化很好的材料。本论文主要从表达和功能两方面来研究两种芳香化酶的区别与联系。一方面通过Real-time PCR和免疫组化技术来研究两者分别在性腺与脑的表达模式以及细胞类型;另一方面通过基因敲除技术研究两者分别在性别决定与分化以及卵巢维持方面的作用。主要研究结果如下:
　　1) Real-time PCR表明cyp19a1b在30、180dah（day after hatching）鱼脑的表达雌性高于雄性。对本实验室测序完成的8个性腺转录组数据分析显示:尼罗罗非鱼中两种芳香化酶（cyp19a1a和cyp19a1b）在性腺中均有表达，且XX性腺比XY性腺表达高，两者均在尼罗罗非鱼性别决定与分化关键时期5 dah开始表达，在性腺的表达均在30 dah达到最高，但此时cyp19a1a高于cyp19a1b。免疫组化研究发现，cyp19a1b在脑中3 dah已经开始表达，在180dah鱼脑表达雌性高于雄性，细胞定位于脑中放射性胶质细胞(radial glial cells，RGCs)，而cyp19a1a在180 dah的脑中存在表达。两者在性腺中的表达模式与转录组分析结果基本一致。两者在XX性腺共表达于卵巢间质细胞，Cyp19a1b还表达于卵巢鞘膜细胞(theca cells);在XY性腺中，Cyp19a1b表达于精巢间质细胞(Ledig cells)中，而未见Cyp19a1a在精巢表达。
　　2)利用CRISPR/Cas9靶向基因敲除技术在尼罗罗非鱼XX个体成功敲除cyp19a1a或/和cyp19a1b，产生了多种突变类型。对照组4月龄XX性腺充满Ⅰ、Ⅱ时相卵母细胞的卵巢，而Cyp19a1a缺失导致XX性腺性逆转为精巢。免疫组化研究发现，在对照组中，Cyp19a1a（雌激素合成酶—芳香化酶）特异表达于卵巢间质细胞（interstitial cells），Dmrt1特异表达于精巢支持细胞(Sertoli cells)以及Cyp11b2（11β-hydroxylase，合成雄激素11-KT的关键酶）在精巢间质细胞表达，而4月龄cyp19a1a缺失性腺基本检测不到Cyp19a1a的表达，但检测到Dmrt1和Cyp11b2的表达，这进一步证实了Cyp19a1a缺失会导致XX性腺逆转为精巢。5月龄Cyp19a1b缺失个体性腺减数分裂受阻，停留在卵原细胞阶段，体细胞增生，不能正常发育为卵巢。免疫组化检测Cyp19a1a、Dmrt1和Gsdf（仅表达于精原细胞和卵原细胞周围的体细胞）在5月龄Cyp19a1b缺失性腺中的表达，结果显示，在对照组中，Cyp19a1a在卵巢间质细胞表达，Dmrt1在精巢支持细胞表达，Gsdf仅在卵巢少量卵原细胞周围的体细胞表达，而在5月龄Cyp19a1b缺失性腺中Cyp19a1a表达降低，Dmrt1有少量表达;存在大量的Gsdf阳性细胞，因此Gsdf染色进一步证实了Cyp19a1b缺失性腺中卵原细胞未进行减数分裂，停留在卵原细胞阶段。Cyp19a1b缺失7月龄XX性腺发育为卵精巢，一部分为有卵母细胞的卵巢部分，一部分为类似精巢组织的部分。免疫组化研究发现，在Cyp19a1b缺失性腺中，Dmrt1表达于卵母细胞周围类似精巢支持细胞的体细胞中，Cyp19a1a表达于卵母细胞周围的间质细胞中，Cyp11b2表达于精巢间质细胞中。由于敲除cyp19a1a4月龄XX性腺就已经逆转为精巢组织，而敲除cyp19a1b XX性腺到7月龄时才部分性逆转，产生卵精巢组织，因此我们推测cyp19a1a在硬骨鱼类卵巢的决定与分化起重要作用，而cyp19a1b可能对卵巢的维持起重要作用。
　　综上所述，两种芳香化酶均在性腺表达，XX性腺（卵巢）比XY性腺（精巢）表达高。两者在XX性腺共表达于卵巢间质细胞，此外，Cyp19a1b还表达于卵巢鞘膜细胞;在XY性腺中，Cyp19a1b表达于精巢间质细胞中，而未见Cyp19a1a在精巢表达。通过在XX个体敲除cyp19a1a和cyp19a1b，我们推测cyp19a1a在硬骨鱼类卵巢的决定与分化起重要作用，而cyp19a1b可能对卵巢维持起重要作用。

目录

声明

英文缩略词

摘要

第一章 文献综述

1 雌激素的生物合成

2 芳香化酶的结构、基因特征

2．1 芳香化酶的结构

2．2 芳香化酶的基因特征

3 硬骨鱼类两种芳香化酶

4 芳香化酶的分布

5 芳香化酶在硬骨鱼中的细胞定位

5．1 芳香化酶(Cyp19a1a)在硬骨鱼性腺的细胞定位

5．2 芳香化酶(Cyp19a1b)在硬骨鱼类脑的细胞定位

6 雌激素在性别决定、分化与卵巢维持方面的作用

7 雌激素在鱼类脑中的作用

8 芳香化酶表达的调控

8．1 促性腺激素

8．2 卵巢芳香化酶(cyp19a1a)基因表达的调控

8．3 鱼类cyp19a1b基因的调节

9 科学问题的提出和本研究的目的意义

第二章 尼罗罗非鱼两种芳香化酶(Cyp19a1a和Cyp19a1b)表达的初步研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验动物

2．2 试剂、耗材和仪器

2．3 实验方法

2．4 免疫组化检测(Cyp19a1a和Cyp19a1b)在性腺与脑组织的表达

3 实验结果

3．1 罗非鱼脑发育中cyp19a1b的表达

3．2 尼罗罗非鱼cyp19a1a和cyp19a1b性腺转录组表达分析

3．3 免疫组织化学检测罗非鱼脑组织Cyp19a1a和Cyp19a1b表达

3．4 免疫组织化学检测罗非鱼性腺组织Cyp19a1a和Cyp19a1b表达

4 讨论

第三章 尼罗罗非鱼两种芳香化酶(Cyp19a1a和Cyp19a1b)功能的初步研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验动物

2．2 试剂、耗材和仪器

2．3 有关试剂的配制

2．4 实验方法

3 实验结果

3．1 CRISPR／Cas9敲除cyp19a1a在尼罗罗非鱼XX性腺发育中的影响

3．2 CRISPR／Cas9敲除cyp19a1b在尼罗罗非鱼XX性腺发育中的影响

3．3 CRISPR／Cas9敲除cyp19a1a、cyp19a1b对XX性腺发育的观察

3．4 XX性腺过表达cyp19a1a对性腺发育的影响

4 讨论

结论

参考文献

致谢

在读期间发表的主要论文

在读期间参加科研情况