中国柑橘溃疡病病原菌多态性研究

摘要

柑橘溃疡病（Citrus canker）是由地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种（Xanthomonasaxonopodis pv.citri）引起的柑橘毁灭性病害。为国内外重大检疫对象，主要侵染芸香科柑橘属、枳属等植物，该病害主要分布在亚洲、非洲及美洲的柑橘主产区。
　　目前，国际上根据病原菌的地理分布和对寄主植物致病性不同，将柑橘溃疡病菌分为A、B、C、D、E等5个菌系和柑橘、枳壳、枳柚3个致病型。柑橘溃疡病在我国广东、广西、福建、江西、浙江、湖南、云南、贵州等柑橘种植省（区）发生较普遍，在四川、湖北等省有局部零星分布。
　　病原菌遗传多样性评估是病原研究的一个重要方向，有助于了解种群遗传结构及病害流行学规律，同时也为病原的检测、病害诊断及风险评估提供敏感、特异的方法。本学位论文在国家公益性行业（农业）科研专项(201003067-02)及教育部长江学者及创新团队（IRT0976）等项目资助下，通过对中国不同地理来源柑橘溃疡病株系进行遗传分析，通过在基因上选择大量位点进行扩增，对株系间基因组的多态性进行了初步评估。本研究主要获得以下研究结果:
　　1、本研究从X.axonopodis pv.citri str.306株系(NC_003919.1)全基因组序列中选择了18个串联重复位点，分别设计相应引物进行PCR扩增，结果显示除6对引物没有扩增条带外，其余12对引物都能检测本实验的样品，其中有4对引物的扩增产物经琼脂糖电泳后表现出明显的多态性差异。因此，这4对引物对应的串联重复位点将用于进一步分析柑橘溃疡病菌的多态性。
　　2、选择上述筛选出的3个串联重复位点对从贵州、湖南、广西、浙江、江西等5省收集的162份柑橘溃疡病样品进行多态性分析。结果显示，湖南、浙江、贵州、广西、江西的柑橘溃疡病菌的多态性存在差异，其中贵州柑橘溃疡病菌表现出的多态性最为复杂，浙江柑橘溃疡病菌的多态性次之。从柑橘品种上看，甜橙上柑橘溃疡病菌的多态性最为复杂，其次依次为桠柑和葡萄柚上的柑橘溃疡病菌。
　　3、通过获得的162个柑橘溃疡病菌样品进行序列分析发现，这些样品在TR3位点的区域出现CGCTTCC和TTCCCCA串联重复序列重复数(TRN)的次数为6-22次，在TR9位点出现TTTCCGA TRN的次数为9-13次，在TR10位点出现CCCGAAT TRN为的次数12-26次。运用MEGA软件对采自各地的162份柑橘溃疡病菌样品进行进一步的聚类分析显示，采自相同省份的柑橘溃疡病菌往往被归为同一簇，且江西的样品与其余地区样品的差异最大，这可能与其地理分布有关。
　　4、为从基因表达量差异的角度来筛选可能存在多态性差异的位点，本研究分析了柑橘溃疡病病原菌分别在28℃下，200mM CuSO4·5H2O处理0h、1h、2h、3h、4h和5h，以及紫外光光处理0 min、15 min、30min、45min和60min后，XAC0922，XAC1380，AC1682, XAC2191, XAC3788, XAC3824, XAC1319, XAC1933, XAC3989和XAC4912等10个基因的表达水平，结果显示XAC4912基因表达量的变化最为剧烈，该基因也许可被用于研究柑橘溃疡病菌的多态性差异。

目录

声明

摘要

缩略词与中英文对照表

第一章 文献综述

1．1 柑橘溃疡病的危害

1．2 柑橘溃疡病的起源与分布

1．2．1 起源

1．2．2 分布

1．3 柑橘溃疡病菌分类地位及发生规律

1．3．1 病原菌分类地位

1．3．2 病害的发生规律与流行

1．4 柑橘溃疡病菌菌系分化及检测

1．4．1 菌系分化

1．4．2 柑橘溃疡病诊断

1．5 柑橘溃疡病病原菌与寄主的互作关系

1．5．1 柑橘溃疡病病原菌寄主范围

1．5．2 柑橘溃疡病病原菌致病因子研究

1．6 柑橘溃疡病病原菌遗传多样性研究进展

1．7 细菌基因组重复序列及其发展

1．8 病害防治及综合治理

1．9 研究的目的和意义

第二章 引言

第三章 筛选柑橘溃疡病病原菌基因组多态性位点

3．1 材料与方法

3．1．1 供试材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 病原菌的鉴定

3．1．4 基因组差异位点筛选和引物设计

3．1．5 PCR反应

3．2 结果

3．2．1 柑橘溃疡病病原菌的检测

3．2．2 18个串联重复位点的PCR扩增

3．3 讨论与分析

3．4 结论

第四章 基于串联重复序列基因位点种群分化的初步研究

4．1 材料与方法

4．1．1 供试材料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．1．4 常用储备液及培养基配制

4．1．5 总核酸提取

4．1．6 引物选择

4．1．7．1 PCR反应

4．1．7．2 目标位点PCR反应体系

4．1．8 PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳和快速银染

4．1．9 PCR产物纯化、克隆与测序

4．1．10 序列分析

4．2 结果与分析

4．2．1 柑橘溃疡病样品中病原菌检测

4．2．2 串联重复序列位点PCR检测

4．2．3 序列分析

4．3 讨论与分析

第五章 柑橘溃疡病病原菌看家基因稳定性差异分析

5．1 材料与方法

5．1．1 供试材料

5．1．2 RNA抽提与cDNA合成

5．1．3 看家基因获取及引物设计

5．1．4 实时荧光定量PCR

5．1．5 数据处理与分析

5．2 结果

5．2．1 RNA抽提质量

5．2．2 引物的特异性及扩增效率

5．2．3 看家基因在不同处理下的基因表达分析

5．3 小结

第六章 主要结论、创新点及研究展望

6．1 主要结论

6．2 创新点

6．3 研究展望

参考文献

致谢

在读期间发表论文及参加科研项目情况