韧皮部杆菌亚洲种简单重复序列(SSR)多态性及其侵染甜橙后转录组学研究

摘要

柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing，HLB）是一种系统性侵染的细菌性病害，是柑橘生产中最具破坏性的病害之一。柑橘植株感病后会出现下列症状:1、叶片斑驳状黄化，后伴随有均匀黄化或缺素型黄化，致树梢黄化状;2、果实沿中轴向一侧歪斜，着色与正常果实相反，又称“红鼻果”，果小质劣;3、树势变弱，后期易死亡。引起该病的病原暂定为韧皮部杆菌属下三个种:韧皮部杆菌亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’，CaLas），韧皮部杆菌非洲种(‘Ca.Liberibacterafricanus’，CaLaf)，韧皮部杆菌美洲种（‘Ca.Liberibacter americanus’，CaLam）。由于病原菌还不能人工纯培养，目前仍然没有完成病原的柯赫式证病实验，同时也给病原的深入研究造成了极大阻碍。现在世界上各大柑橘产区，包括非洲、亚洲、北美洲和南美洲的近50个国家和地区都有发生。该病尚无有效防治药剂，一旦植株染病，通常只能砍树。该病仍呈不断蔓延之势，产量过千万吨的中国、巴西和美国均受到其严重威胁，倍受产业关注。
　　本文从以下三个方面展开研究:1、基于该菌培养“成功”的报道，验证和探索病原菌的人工培养方法;2、通过收集中国境内不同地理来源的菌群，筛选SSR位点，研究群体结构;3、对甜橙感染CaLas后的转录组学开展研究，取得如下结果。
　　1、对已报道三种实时检测方法进行了比较，发现Teixeira等所建立的方法稳定性和灵敏性较好，不易出现假阳性的结果，因此选定该方法作为病原培养时检测方法。并针对该方法建立标准曲线，用于定量监测病原是否发生增殖。根据已报道培养方法和柑橘木质部及韧皮部难培养菌培养方法，结合CaLas全基因组信息，进行培养探索。经过大量重复实验，未能重复成功，迄今也没有其他实验室成功重复已有报道结果，以往“成功”报道，仍属孤证实验。所试验8种培养基中，2G培养基可以最长时间检测到病原，但并没有观察到明显增殖，培养方法还需进一步探索，找寻支持病原生长的关键因子。
　　2、对已报道SSR位点进行了筛选，发现其中5个位点在中国样品中存在变异，这5个位点分析中国样品时的Nei's多样性指数H在0.1542～0.9556区间。基于这5个SSR变异位点，对收集到的中国285份CaLas样品进行群体结构分析后发现，中国CaLas可明显被分为两个组群，东南地区样品群体构成以其中一组为主，西南地区以另一组为主。其中东南地区样品两个组群混杂程度高于西南地区，表现出各个省份混杂程度均高于西南地区。西南地区样品群体构成相对单一，特别是云南和四川样品，几乎为同一种群组成，受到其它菌群影响较少。福建省样品表现出一定的特殊性，地理位置上为中国东南地区，菌群构成上却和西南地区相近。不同组群间CaLas引起寄主症状都以斑驳状黄化为主，暂时没有观察到症状上的分化。本研究还基于其中3个SSR位点，对中国和世界上其他部分国家CaLas样品进行了聚类分析，所有样品被分为两个组群:中国CaLas群体组成和巴西、印度和柬埔寨相似，但是中国样品表现出更高的混杂性;美国菌群主要为另一组群，构成相对单一。
　　3、对感染CaLas的甜橙（Citrus sinensis）转录组学研究，筛选出1077个差异表达基因(DEGs)，这些DEGs主要涉及植物的运输、碳水化合物代谢、光合作用及激素等方面。分析这些DEGs所涉及具体代谢途径:蔗糖代谢途径中蔗糖转化酶上调4倍，果糖代谢途径中果糖激酶下调2倍，淀粉分解代谢途径中γ-淀粉酶被下调2倍。这些酶的变化可能会导致植物淀粉的积累，进一步可能会导致植物可溶性糖，特别是蔗糖的减少，造成植物营养供给不足。并未出现大规模的糖类相关代谢基因被差异表达，推测原因是因为接种植株仍处于发病初期阶段，因而糖类代谢并没有出现严重紊乱。与植物抗逆相关代谢途径被激活，包括:1、缓解过氧化环境和抗逆相关的抗坏血酸合成途径中相关基因被上调，2、植物激素中水杨酸信号途径被激活，3、谷胱甘肽转移酶、热激蛋白等相关基因也都被上调表达，这些说明寄主通过各种途径在抵御病原的进一步侵染。植物光合作用中，光吸收复合体等相关基因被下调，会影响植物的光合作用，植物激素中生长素和细胞分裂素信号转导途径的相关基因也被下调，这些差异表达可能会对植株的生长发育等造成负面影响。
　　4、选取敏感品种岩溪晚芦椪柑品系(C.reticulata)和耐病品种卡里佐枳橙品系（Poncirus trifoliata），接种相同CaLas毒源，椪柑可在8周左右检测到CaLas，15周时病原含量已较大，枳橙在相同时间段内检测不到病原或偶能检测到极低浓度的存在。但是，在嫁接于枳橙的毒源芽段发出的芽中可以检测到病原，推断枳橙对病原的扩散具有一定的限制作用，CaLas较难在枳橙中增殖。在症状上，椪柑出现生长势变弱、叶片变小、部分叶片黄化等症状，而枳橙未出现任何症状。选取光合作用、激素、钙信号转导途径及锌离子转运等途径的DEGs，进行表达量验证，结果发现光合作用途径中，耐病品系表现出更少的基因被下调，在植物激素信号转导途径中，有更多的抗逆相关途径被激活。而且所验证的DEGs，多数在耐病品系中表达量更高，这些可能与其表现出的耐病性相关。