青蒿素和白藜芦醇协同抗肿瘤作用及其复方囊泡的制备研究

摘要

青蒿素作为有效的抗疟药物，主要机制是通过与疟原虫中的高铁成分结合后，发生化学反应，产生可以破坏细胞膜的“自由基”，从而使单细胞疟原虫死亡。癌症细胞的分裂过程中复制DNA需要大量铁质，所以癌细胞的铁质含量要远远高出正常细胞，因此引入青蒿素，可有选择性地杀死癌细胞。白黎芦醇是一种多酚化合物，研究发现其在肿瘤的启动、发生和发展三个阶段均发挥强大的抗肿瘤作用其主要机制是诱导细胞调亡，抑制DNA合成，抑制增进作用，抑制环氧合酶(COX)，抑制过氧化氢酶等。但是青蒿素和白藜芦醇同时作为中药单体两者的IC50（半数抑制浓度）均非常高，临床用量较大。故考虑将两药合用，利用青蒿素与白藜芦醇抗肿瘤机制的互补性，两药合用来增强其抗肿瘤效果，同时由于两药的低毒性，可大大降低一般抗肿瘤药物所带来的机体毒性，有助于提高患者临床护理。除此之外，白藜芦醇和青蒿素是脂溶性药物，水溶性差，口服吸收差，且没有靶向性，代谢速率过快，体内代谢不稳定，故临床应用受到很大限制。非离子表面活性剂囊泡（类脂质体）是一种有效的药物输送载体，具有类似细胞的结构，它具有与脂质体一样有一定的的靶向性能，但较稳定，并且可以改变被包封药物在体内的分布情况，它具有多方面的优点如靶向、长效以及增加药物稳定性等。因此，试图把两药合在一起制成复方囊泡，以提高药物的生物利用度，发挥更好的抗肿瘤效果。
　　通过体外HeLa和HepG2肿瘤细胞模型，MTT实验发现合用青蒿素和白藜芦醇可明显提高药物对肿瘤细胞的杀伤率，两药的IC50均大大的降低，另外采用CI值和等效线法发现，青蒿素和白藜芦醇对HeLa和HepG2产生协同抗癌作用。进一步利用AO染色显微镜观察和流式细胞法检测药物对细胞凋亡的作用，实验表明两药合用对HeLa细胞的早晚期细胞凋亡均有更好的诱导作用。因此，诱导癌细胞凋亡是两药合用抗肿瘤的作用机制之一。为了考察两药合用对肿瘤细胞迁移的作用，采用细胞划痕法，对细胞的迁移率进行了检测，结果表明，两药合用对HeLa细胞迁移的抑制作用要明显优于单独用药组。除此之外，考察了两药对Hela细胞内ROS的影响，通过对对照组和单药组的显微镜观察发现细胞的发光亮度要明显弱于合用组可认为对照组和单药组的ROS产量明显低于合用组，说明两药合用能够有效促进癌细胞内ROS产生，从而进一步导致了Hela细胞的死亡。
　　在两药复方囊泡的制备实验中，采用薄膜分散法制备复方囊泡，通过对囊泡的包封率、δ电位和粒径的检测，对处方进行了进一步的优化。通过最优处方制备的复方囊泡中青蒿素和白藜芦醇的包封率75.8％和61.5％。同时体外释放度实验也发现，两药从囊泡中的释放是一个缓慢的过程，表明药物可以在释放介质中保持更好的的稳定性，因此复方囊泡可以达到一个更好的传递效果，满足有效药物传递的要求。
　　将中药单体青蒿素和白藜芦醇合用于抗肿瘤治疗中，具有低毒性，安全性高的优点，可以明显提高抗肿瘤效果。同时将两种药物用囊泡包合后能明显改善药物自身的水溶性低，药理作用不明显等缺点，增加药物生物利用度和稳定性，可以为中药单体作为抗肿瘤药物方面的应用提供一定的价值。但是，目前的研究还不够全面，更深入的分子机制以及体内外实验仍然有待进一步研究。

目录

声明

摘要

中英文缩略表

第1章 文献综述

1．1 青蒿素的药理活性

1．1．1 抗疟作用

1．1．2 抗肿瘤作用

1．1．3 抗炎作用

1．1．4 免疫抑制作用及抗变态反应

1．2 青蒿素抗肿瘤机制

1．2．1 氧化损伤

1．2．2 抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡

1．2．3 抗肿瘤新血管生成

1．2．4 抑制肿瘤细胞的侵袭和转移

1．3 白藜芦醇的药理作用

1．3．1 抗肿瘤作用

1．3．2 保护心血管作用

1．3．3 免疫调节作用

1．4 白藜芦醇的抗肿瘤机制

1．4．1 抑制肿瘤细胞增殖

1．4．2 诱导肿瘤细胞凋亡

1．4．3 干扰肿瘤相关信号转导通路

1．5 囊泡的简介

1．5．1 囊泡的组成

1．5．2 囊泡制备方法

1．5．3 影响包封率的因素

第2章 引言

第3章 青蒿素和白藜芦醇协同抗肿瘤作用的研究

3．1 仪器及材料

3．1．1 仪器

3．1．2 试剂

3．1．3 细胞系

3．2 实验方法

3．2．1 细胞培养

3．2．2 细胞增殖检测

3．2．3 CI值和等效线法分析两药协同作用

3．2．4 诱导细胞凋亡和坏死作用的显微镜观察

3．2．5 细胞凋亡的的流式细胞法测定

3．2．6 划痕法检测细胞迁移作用

3．2．7 活性氧水平的检测

3．2．8 统计分析方法

3．3 实验结果

3．3．1 青蒿素和白藜芦醇合用对Hela和HepG2癌细胞增殖的影响

3．3．2 青蒿素和白藜芦醇的合用效果

3．3．3 两药的合用比例的不同对Hela细胞抑制率的影响

3．3．4 AO测定两药对Hela细胞凋亡率的影响

3．3．5 流式细胞法检测两药合用引起的细胞凋亡

3．3．6 两药合用对Hela细胞迁移的影响

3．3．7 青蒿素和白藜芦醇合用对Hela细胞内ROS的影响

3．4 讨论

3．5 小结

第4章 青蒿素和白藜芦醇复方囊泡的制备研究

4．1 仪器和材料

4．1．1 仪器

4．1．2 试剂

4．2 实验方法

4．2．1 空白囊泡的制备

4．2．2 最大吸收波长的确定

4．2．3 青蒿素和白藜芦醇溶液标准曲线的绘制

4．2．4 青蒿素和白藜芦醇复方囊泡的制备

4．2．5 溶液稳定性考察

4．2．6 回收率试验

4．2．7 囊泡包封率的测定

4．2．8 体外释放度实验

4．2．9 统计分析方法

4．3 实验结果

4．3．1 正交试验所得最优制备条件

4．3．2 复方囊泡的特征检测

4．3．3 囊泡的体外释放度检测

4．4 讨论

4．5 小结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间研究成果