鼻咽癌中Pin1异构酶的作用及其对转录因子ATF1的调控机制

摘要

目的：⑴研究Pin1异构酶启动子单核苷酸多态性（-842G＞C，rs2233678和-667T＞C，rs2233679）与鼻咽癌发病风险和临床资料的关系；⑵研究Pin1异构酶调节转录因子ATF1对鼻咽细胞恶性表型的影响以及Pin1异构酶对ATF1的调节作用。旨在为鼻咽癌早期的基因型诊断以及靶向治疗提供科学依据，寻求鼻咽癌防治新的靶点。
　　 方法：①收集178位鼻咽癌病人及156位正常对照人群血细胞标本，采用天根公司的“血液、组织、细胞基因组DNA提取试剂盒”，按照试剂盒具体步骤进行提取DNA，将包含两个SNP位点的DNA通过限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)方法判定基因型，并随机抽取一定比例（约20例）的样品用测序的方法进行结果验证。应用SPSS16.0统计软件对鼻咽癌病人及正常人两个SNP位点的基因型分布差异及关联性进行分析，应用拟合优度x2检验对对照组基因型频率分布行Hardy-Weinberg平衡分析。p＜0.05具有统计学意义。②培养人鼻咽癌高分化细胞株CNE-1和低分化细胞株CNE-2Z细胞，构建Pin1及ATF1的真核表达载体及mU6Pro siRNA-Pin1干扰载体。将Pin1及ATF1的真核表达载体分别转染或共同转染到CNE-1细胞，筛选出稳定表达的细胞克隆;将Pin1及ATF1的mU6Pro siRNA干扰载体分别转染或共同转染到CNE-2Z细胞，筛选出稳定表达的细胞克隆。用瞬间转染和稳定转染所得的细胞以及Pin1抑制剂Juglone处理后的细胞通过CCK8法、克隆形成实验、Chamber invasionassay、流式细胞分析检测细胞体外致瘤能力改变。用蛋白质免疫共沉淀及共聚焦实验分析Pin1和磷酸化ATF1是否可能在细胞内存在相互作用及共定位。采用荧光素酶报告基因系统，对ATF1转录活性是否受Pin1异构酶调节进行了分析，应用SPSS16.0统计软件分析实验数据。p＜0.05具有统计学意义。
　　 结果：⑴对照组基因型频率分布进行Hardy-Weinberg平衡分析(p=0.056 for-667T＞C and p=0.063 p＞0.05)，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，具有群代表性。⑵在-667T＞C，rs2233679位点，携带杂合子CT或者CC基因型的人患有鼻咽癌的风险低于携带纯合子TT基因型的人(OR=0.639，95％ CI=0.452-0.903，p=0.011 for-667CT; and OR=0.441,95％ CI=0.213-0.915,p=0.038 for-667CC,respectively)。在-842G＞C位点，携带GC杂合子的人患鼻咽癌风险明显比携带GG纯合子基因的人要低(OR=0.465，95％ CI=0.249-0.871，p=0.010)。但是CC纯合子与GG纯合子相比较统计学差异不显著。⑶对于病例组-667T＞C，rs2233679和-842G＞C，rs2233678两个多态性位点的临床资料进行分组分析，发现年龄、性别、TNM临床分期和淋巴结转移各分组中差别均无统计学意义(p＞0.05)。⑷免疫组织化学结果:Pin1和pATF1(ser63)均在鼻咽癌组织中高表达，而在非瘤性鼻咽组织（癌旁组织、慢性炎症及正常鼻咽组织）中均低表达。⑸激光共聚焦实验结果显示:Pin1和ser63位点磷酸化的ATF1可能存在细胞内共定位现象。⑹Western blot证实:Pin1和ser63位点磷酸化的ATF1存在相互免疫共沉淀，提示二者可能存在细胞内相互作用。⑺CCK8结果显示:Pin1稳定表达的细胞与对照相比，细胞增殖能力明显增强。⑻细胞周期分析:Pin1稳定表达的细胞与对照相比G1、G2期明显增多，S期明显减少。⑼平板克隆实验结果显示:Juglone对CNE-2Z细胞平板克隆形成能力有明显抑制作用，且随着剂量增加而逐渐增强;瞬间转染Pin1或ATF1的鼻咽癌细胞克隆形成能力增强。共转Pin1及ATF1组，与单独转染Pin1组相比，克隆形成能力增强明显，差异有显著性;但与单独转染ATF1组相比，克隆形成能力没有明显增强。⑽CCK8实验结果表明，Pin1抑制剂Juglone能明显抑制CNE-2Z细胞增殖，随着Juglone浓度的增加对CNE-2Z细胞增殖抑制越明显。⑾Chamber invasion assay结果显示juglone抑制CNE-2Z细胞的侵袭能力也存在明显剂量效应关系。⑿Western blot结果:Pin1抑制剂juglone处理CNE-2Z细胞后，ATF1磷酸化水平随着juglone浓度的增加而减少;而鼻咽癌细胞中稳定表达Pin1后ATF1表达水平也会增加。⒀转录因子ATF1荧光素酶报告基因结果显示:Pin1稳定表达的细胞与对照细胞相比，荧光素酶活性明显增加。
　　 结论：①Pin1异构酶启动子单核苷酸多态性（-842G＞C，rs2233678和-667T＞C，rs2233679）与鼻咽癌发病风险有关系。在-667T＞C，rs2233679位点，携带纯合子TT基因型的人患病风险更高。在-842G＞C位点，携带GC杂合子的人患鼻咽癌风险更高些。②Pin1异构酶启动子单核苷酸多态性（-842G＞C，rs2233678和-667T＞C，rs2233679）可能与鼻咽癌临床资料无相关性。③Pin1及ATF1在鼻咽癌组织中均高表达，而且两者表达水平呈正相关。④ Pin1异构酶和Ser63位点磷酸化的转录因子ATF1在鼻咽癌细胞中可能存在相互作用及共定位。⑤Pin1异构酶可以促进ATF1转录活性，从而促进鼻咽癌细胞恶性增值和转化。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目标

1．3 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3、结果

4 讨论

5 小结

参考文献

附录一：缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况